甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

劉大麗 ，馬龍彪 ，郝 慧

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

甜菜是我國重要的糖料經(jīng)濟(jì)作物之一。甜菜的品質(zhì)主要取決于可溶性糖的含量和種類[1]。蔗糖是甜菜體內(nèi)有機(jī)物運輸?shù)闹饕问剑彩翘妓衔镔A藏和積累的主要形式[2]。在我國北方，甜菜單產(chǎn)不高，塊根蔗糖含量大幅下降，已成為制約我國甜菜糖業(yè)發(fā)展的重要問題。

植物蔗糖磷酸合成酶 （Sucrose phosphate synthase,SPS,EC=2.4.1.14）在蔗糖合成過程中扮演著重要角色，它主要通過異構(gòu)調(diào)節(jié)和磷酸化修飾在酶水平調(diào)節(jié)蔗糖合成[3]。SPS最初在小麥中被發(fā)現(xiàn)并得到純化[4]，隨后在玉米和菠菜中也純化了SPS，它是由分子量為117～138kDa的亞基構(gòu)成的二聚體或四聚體[5]。SPS是一種低豐度蛋白，它能催化UDP-glucose+D-fructose 6-phosphate=UDP+sucrose 6（F）-phosphate反應(yīng)，而這種催化蔗糖生成的反應(yīng)由于SPS的內(nèi)在特性事實上又是不可逆的，因此，SPS是蔗糖合成過程中最為關(guān)鍵的酶之一[6,7]。本研究主要利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了甜菜蔗糖磷酸合成酶（BvSPS）基因片段，并對其序列進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及試劑

實驗所用的甜菜試管苗由黑龍江省高校重點實驗室提供。pMD18-T載體 （TaKaRa）；大腸桿菌DH5α（Keygen）；RNA 電泳所需試劑：20×MOPS：8.87%（m/v） MOPS、1.36%（m/v） NaAc、0.744%（m/v） EDTA-2Na，pH=7.0；變性液：Formamide/10×MOPS/Formaldehyde=15/5/8。未特殊注明的試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 RNA的提取與濃度測定

實驗利用BIOZOL（BioFlux）試劑提取甜菜總RNA。稱取1g甜菜試管苗幼嫩葉片組織于5mL BIOZOL試劑中，室溫溫育15min；離心；將上層清液中加入1/5體積的氯仿，冰浴15 min；再次離心，將上層清液中加入等體積異丙醇，于-20°C放置30min；離心后，將沉淀于1mL 70%乙醇中洗滌兩次，晾干后，溶于DEPC水中，儲存于-70°C備用。利用紫外分光光度計，分別在OD260和OD280條件下測定RNA的含量和純度，并將樣品的濃度稀釋成1μg/μL備用。取2μg總RNA，加入15.8μL變性液，電泳緩沖液為1×MOPS，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)甜菜BvSPS基因的序列（Genbank accession no.X81975）信息，利用Primer premier 5.0設(shè)計上游引物（5'-3'）：ATG GCG GGA AAT GAT TGG AT；下游引物（5'-3'）：TTA AGC TTT GGA GAG TTT TG，擴(kuò)增BvSPS基因的CDS長度為3138bp。擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.4 RT-PCR

實驗在12μL的反應(yīng)體系中加入 3μg RNA、10μM Oligo dT以及RNase free H2O于 65°C反應(yīng) 5min，并立即置于冰上；向第一步變性反應(yīng)液中加入5×RT Buffer，20mM dNTPs，10U RNase Inhibiter以及20U的Rever Tra Ace （ToYoBo），總體積為 20μL。 反應(yīng)條件為 42℃ 60min；99°C 5min；4℃ 5min。 所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?PCR 擴(kuò)增：50μL 的反應(yīng)體系中， 分別加入 2μL cDNA 模板，5μL 10×Taq Buffer、4μL 10mM dNTPs、1μL 20μM 上游引物和下游引物，0.5μL rTaq（TaKaRa）。 PCR 擴(kuò)增條件為：94°C 預(yù)變性 5min；94°C（30s），52°C（45s），72°C（3min），30 個循環(huán)；最后 72℃延伸 10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物于 1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并利用 GeneSnap 6.08（f）進(jìn)行檢測。

1.5 載體構(gòu)建及序列分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，回收；將pMD18-T載體和BvSPS回收片段按照摩爾比1∶5進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過Amp抗性及藍(lán)白斑篩選出待測陽性克隆。待測陽性克隆經(jīng)過提質(zhì)粒，酶切鑒定，從而進(jìn)一步確定重組子。利用ORF Finder，PSORT（Prediction of Protein Localization Sites），ExPASy等各種生物信息學(xué)軟件，對BvSPS基因的ORF區(qū)域、分子量、等電點等信息進(jìn)行預(yù)測及序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvSPS基因CDS全長的獲得

實驗以甜菜試管苗為材料，利用BIOZOL試劑提取了甜菜總RNA。如圖1A所示，電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下清晰可見，并且，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍左右，這說明RNA基本上沒有被降解，且無彌散。同時，加樣孔附近沒有雜帶，說明產(chǎn)物中沒有DNA存在；在18S rRNA下方存在一些較為模糊的條帶，這可能是由tRNA，5.8S RNA和5S rRNA組成的遷移較快的條帶。這些結(jié)果都說明了實驗獲得了較高純度和得率的甜菜總RNA。

以甜菜總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶成功獲得了cDNAs。通過RT-PCR擴(kuò)增，實驗在3.1kb左右的位置獲得了目的片斷（圖1B）。這與BvSPS基因的CDS全長的大小3.138kb相一致。

2.2 pMD 18-T-BvSPS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR獲得的BvSPS基因片段進(jìn)行回收，與pMD 18-T連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。挑取白斑克隆，提質(zhì)粒。通過對BvSPS基因序列的限制性內(nèi)切酶分析，選取沒有酶切位點的PstI和XbaI以及在1292bp位置上有一個酶切位點的EcoRI來對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖2A）；而這3種限制性內(nèi)切酶在T載體上均有一個酶切位點。

如圖2B所示，經(jīng)過PstI單酶切重組質(zhì)粒，獲得了5.83kb左右的片段，這與T載體（2.69kb）和BvSPS全長（3.14kb）加起來的總長基本一致；同時，利用T載體兩側(cè)的PstI和XbaI酶切位點酶切重組質(zhì)粒，獲得了兩條位于3.14kb和2.69kb左右位置的條帶，分別是BvSPS基因和T載體。為了更進(jìn)一步的確認(rèn)基因的正確性以及目的基因的插入方向，實驗利用EcoRI酶切重組質(zhì)粒，并獲得了3.98kb和1.86kb左右的兩條片段，根據(jù)EcoRI在BvSPS基因內(nèi)部以及T載體上的位置，可以確定BvSPS基因被逆向插入到T載體上。

2.3 BvSPS基因的序列分析

根據(jù)BvSPS基因在Genbank中的登錄號X81975，獲得該基因的堿基及其開放讀碼框的氨基酸序列信息（表1）。BvSPS基因的cDNA全長為3138bp，它編碼了1045個氨基酸；通過ExPASy軟件分析，由這些氨基酸所組成的蛋白的分子量為118.18kDa，等電點為6.15；通過PSORT軟件預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞核；該蛋白編碼的甜菜蔗糖磷酸合成酶（EC=2.4.1.14）可以催化UDP-glucose+D-fructose 6-phosphate=UDP+sucrose 6（F）-phosphate反應(yīng)，因而對蔗糖合成起著至關(guān)重要的作用。

表1 BvSPS基因及所編碼蛋白的生物信息

3 討論

蔗糖是甜菜根中糖積累的主要形式，是甜菜品質(zhì)形成的重要因子，而甜菜蔗糖磷酸合成酶（BvSPS）在蔗糖代謝中起著重要作用，它的活性直接反映了甜菜體內(nèi)蔗糖合成的能力。通過克隆BvSPS基因，可以進(jìn)一步地將其構(gòu)建于含有強啟動子或根特異表達(dá)啟動子的植物表達(dá)載體上，再重新轉(zhuǎn)化到甜菜體內(nèi)，利用密碼子的偏愛性，使其在甜菜體內(nèi)或其貯糖根部更加強效的表達(dá)，以期提高甜菜根的含糖量及甜菜品質(zhì)。

[1]Fiew S,Willenbrend J.Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase in sugar beet plants(Beta vulgaris L.ssp.altisima)[J].J Plant Physiol,1987,131:153-162.

[2]Farrar J,Pollock C,Gallagher J.Sucrose and the integration of metabolism in vascular plants[J].Plant Sci,2000,154:1-11.

[3]Huber SC,Huber JL.Role of sucrose phosphate synthase in sucrose metabolism in leaves[J].Plant Physiol.,1992,99:1275-1278.

[4]Hawker J S.Enzymes concerned with sucrose synthesis and transformations in seeds of maise,broad bean and castor bean[J].Phytochem,1971,10(10):2313-2322.

[5]Klein R R,Crafts Brandner S J,Salvucci M E.Cloning and developmental expression of the sucrose phosphate synthase gene from spinach[J].Planta,1993,190(4):498-510.

[6]Lunn J E,Macrae E.New complexities in the synthesis of sucrose[J].Curr Opin Plant Biol,2003,6(3):208-214.

[7]Cumino A,Curatti L,Giarrocco L,et al.Sucrose metabolism:Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minmal functional domains shuffled during evolution[J].FEBS Lett,2002,517(1-3):19-23.