甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究

李 松，余坤興，劉麗敏，淡 明 ，劉紅堅，楊 柳，譚 芳，游建華，戴友銘

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所，南寧 530007；3.廣西大學(xué)，南寧530005）

甘蔗是中國最主要的糖料作物，其種植面積占糖料總面積的85%左右，蔗糖產(chǎn)量占食糖產(chǎn)量的90%以上。甘蔗屬于無性繁殖且長期連作作物，易受各種病害的積累且傳播快，尤其是目前應(yīng)用化學(xué)藥物無法防治的甘蔗宿根矮化病（RSD）和花葉病等病害嚴(yán)重發(fā)病，種性退化，產(chǎn)量、質(zhì)量急劇下降。莖尖培養(yǎng)去除甘蔗宿根矮化病和花葉病，生產(chǎn)脫毒健康種苗是恢復(fù)甘蔗優(yōu)良種性、提高甘蔗工農(nóng)效益最有效的技術(shù)措施[1]。甘蔗迅速大量繁殖試管苗，可通過兩種方式：一種是誘導(dǎo)嫩葉外植體產(chǎn)生愈傷組織，由愈傷組織分化植株（Lee,T.S.G，1986;Lee,T.S.G，1987;Daniela Cidade et al,2007）[2,3,4]；另一種是培養(yǎng)莖頂生長點附近的芽（頂芽、腋芽），使之大量分蘗繁殖。繁殖一定數(shù)量后，誘導(dǎo)芽長出根，形成完整植株（Hu,C.Y et al，1983;S Lakshmanan P et al，2006；Imtiaz Ahmed Khan et al，2006）[5,6,7]。我國利用甘蔗外植體進(jìn)行良種快繁的研究工作起步較早，20世紀(jì)70年代通過愈傷組織[8]、腋芽[9]等進(jìn)行甘蔗良種快繁，并大面積應(yīng)用于生產(chǎn)；1994年許莉萍[10]報道了莖尖培養(yǎng)去除甘蔗花葉病毒。對甘蔗莖尖培養(yǎng)去除甘蔗宿根矮化病的研究工作開展較晚，但進(jìn)展較快，并已進(jìn)入推廣應(yīng)用階段[11]。但是甘蔗莖尖培養(yǎng)擴(kuò)繁量小，成本高，不利于在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。本研究著重于以莖尖細(xì)胞培養(yǎng)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，實現(xiàn)深度去病去毒和大幅度提高擴(kuò)繁量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種選用目前廣西當(dāng)家甘蔗品種新臺糖22號，由廣西甘蔗研究所生物技術(shù)研究室提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 組培苗繁育方法 設(shè)莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體后分化成苗（處理A）、莖尖直接分化成苗（處理B）與腋芽直接分化成苗（處理C）3種繁育方法。

莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體后分化成苗方法，即從田間取回生長健壯的新臺糖22號宿根植株，將蔗莖砍成單芽段，在30℃條件下培養(yǎng)20d左右，經(jīng)常規(guī)消毒后剝?nèi)?～2mm的莖尖分生組織在黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基為：MS+2，4-D 2.5mg/L＋NAA 0.1mg/L；待愈傷組織誘導(dǎo)形成后轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，配方為：MS+2，4-D 1.5mg/L＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.1mg/L；胚狀體形成后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，在自然光照條件進(jìn)行綠芽分化，培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 1.0mg/L＋NAA 0.1mg/L；對所得綠苗進(jìn)行試驗研究。以上培養(yǎng)溫度為27±1℃，光照為自然散射光。

莖尖直接分化成苗方法，即如上所述方法獲取甘蔗的莖尖在MS+6-BA 1.0mg/L＋NAA 0.1mg/L濾紙橋上進(jìn)行分化培養(yǎng)；對分化培養(yǎng)獲得的莖尖組培苗進(jìn)行試驗研究。培養(yǎng)條件與莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體后分化成苗方法相同。

腋芽直接分化成苗方法，即上述相同新臺糖22號材料，將蔗莖砍成單芽段，經(jīng)用清水洗凈、75%酒精擦表皮后，用0.2%的升汞消毒12min，無菌水沖洗3次，接種在MS+6-BA 1.0mg/L＋NAA 0.1mg/L進(jìn)行腋芽培養(yǎng)。所獲得的腋芽組培苗進(jìn)行試驗研究。培養(yǎng)條件與莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體后分化成苗方法相同。

1.2.2 組培苗繁殖影響因素設(shè)計 以春植蔗為材料，于8月5日、10月5日、12月5日3個生長時間段進(jìn)行取樣處理接種，每個時間段觀察不同時期接種各種繁育方法對外植體成活情況的影響。以8月5日接種單芽為單位獲得的活外植體經(jīng)1.2.1分化成苗后，進(jìn)行以下研究：

（1）不同激素水平的不同繁育方式組培苗快繁研究：采用二因素，6-BA 五水平：0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L；NAA四水平：0、0.01、0.05、0.1mg/L進(jìn)行試驗，以篩選不同類型組培苗培養(yǎng)的最適繁殖培養(yǎng)基。以供體單芽為單位，取生長基本相近的芽系苗，每個培養(yǎng)基處理為3瓶苗，每瓶1個單芽株系苗，設(shè)3次重復(fù)，增殖5代后進(jìn)行組培苗快繁數(shù)據(jù)收集。

（2）不同激素水平組培苗生根試驗：采用二因素NAA和ABA各四水平：0、2.5、5.0、7.5mg/L進(jìn)行試驗，每種培養(yǎng)基處理為5瓶苗，4次重復(fù)。培養(yǎng)30d后進(jìn)行組培苗生根數(shù)據(jù)收集。

1.2.3 不同處理方式的脫毒效果試驗 12月15日從田間選擇生長一般，明顯感染花葉病的蔗株，采回后取蔗莖中下段蔗汁進(jìn)行PCR檢測證實含RSD后，將帶RSD的甘蔗側(cè)芽按1.2.1的三種繁育方式進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理接種30個芽，獲得的組培苗以每個側(cè)芽為單位建立株系苗，定量比較其脫毒效果。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 外植體成活率 外植體接種培養(yǎng)一段時間后，部分外植體因真菌、細(xì)菌、褐化等污染因素導(dǎo)致死亡，外植體成活率即成活外植體數(shù)占接種總數(shù)的百分率。接種后每天上午觀察一次，因人為操作而非材料因素造成的真菌、細(xì)菌污染不列入統(tǒng)計范圍。

1.3.2 組培苗繁殖速度與質(zhì)量 內(nèi)容主要有：增殖速度、假莖高度、假莖粗、葉片長度、每瓶苗鮮重等。以接種外植體單芽為基數(shù)，在1.2.2（1）培養(yǎng)條件下增殖至第5代，對上述內(nèi)容進(jìn)行統(tǒng)計：增殖速度，處理A、B、C在6-BA 0mg/L+NAA 0-0.1mg/L配比培養(yǎng)條件下統(tǒng)計全部苗數(shù)，其余配比培養(yǎng)條件下的苗數(shù)，各配比取有代表性的瓶苗，其中，處理A取10瓶苗，處理B、C取總瓶數(shù)的1/4進(jìn)行統(tǒng)計，平均每瓶苗的株數(shù)，然后乘增殖總瓶數(shù)，累加得出其增殖總苗數(shù)（增殖速度）。

假莖高度、假莖粗、葉片長度、每瓶苗鮮重，處理A、B、C均以6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L配比相同培養(yǎng)條件下統(tǒng)計。隨機(jī)抽取100株苗，測定假莖高度、假莖粗、葉片長度，其中假莖高度，用30cm長的直尺測定，以基部起至＋1葉肥厚帶止，取平均值；假莖粗，用游標(biāo)尺測蔗苗假莖中部，取平均值；葉片長度，用30cm長的直尺每株苗＋1葉葉片長度，取平均值；每瓶苗鮮重，不同處理各取20瓶有代表性的瓶苗，洗凈培養(yǎng)基，在陰涼處自然風(fēng)干水分后用電子分析天平稱重，取平均值。

1.3.3 不正常組培苗 內(nèi)容主要有：白化苗、細(xì)弱小苗、玻璃化苗、瘋長苗。以瓶為單位對1.2.2（1）的各處理試驗瓶苗進(jìn)行統(tǒng)計。白化苗，即蔗苗完全失綠呈白色或部分失綠呈白綠相間，每瓶苗中有1株以上白化苗均入統(tǒng)計范圍；細(xì)弱小苗，即蔗苗假莖比正常苗小一倍以上，增殖速度極慢，葉片細(xì)長偏黃，一瓶苗約有1/3以上蔗苗出現(xiàn)此現(xiàn)象均列入統(tǒng)計范圍；玻璃化苗，即蔗苗腫脹失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，增殖能力降低，一瓶苗約有1/3以上蔗苗出現(xiàn)此現(xiàn)象均列入統(tǒng)計范圍；瘋長苗，即蔗苗增殖速度較快，蔗苗矮小，高度為正常苗一半左右，一瓶苗約有1/2以上蔗苗出現(xiàn)此現(xiàn)象均列入統(tǒng)計范圍。

1.3.4 不同激素水平對組培苗生根的影響 內(nèi)容主要有：生根率、每瓶苗生根率、每株苗根數(shù)、移栽成活率等。生根率，即生根瓶苗數(shù)占試驗瓶苗總數(shù)的百分率；每瓶苗生根率，即組培苗轉(zhuǎn)接生根試驗后20d，隨機(jī)抽取50瓶生根苗，以有2片葉以上（含2片葉）的蔗苗為標(biāo)準(zhǔn)苗，長有1條根（含1條）以上的列入統(tǒng)計范圍，取平均值；移栽成活率，所有參試生根苗進(jìn)行移栽，根據(jù)1.3.2與每瓶苗生根率計算移栽生根苗數(shù)，移栽后約30d進(jìn)行分株假植育苗，并統(tǒng)計假植苗數(shù)，假植苗數(shù)占移栽生根苗數(shù)的成分率為移栽成活率。

1.3.5 RSD檢測、花葉病檢測 對1.2.3不同處理試驗苗采用PCR技術(shù)進(jìn)行RSD、花葉病病源檢測，檢測方法參照鄧展云[12]、李利君[13]，每個處理隨機(jī)抽取10瓶進(jìn)行檢測，空白對照為樣品提取緩沖液，陽性對照和陰性對照分別為經(jīng)鑒定已感染RSD、花葉病病毒和未感染RSD、花葉病病毒的甘蔗植株，由廣西甘蔗研究所生物技術(shù)研究室提供。根據(jù)顯色結(jié)果，并與空白、陰性及陽性對照比較，判定是否感染病毒。每個樣品均重復(fù)試驗3次，若三者均為陽性則記為陽性，三者均為陰性則記為陰性，陽性、陰性均有出現(xiàn)則記為不能確定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理用SPSS統(tǒng)計軟件，利用LSD（Least-significant difference）最小顯著差數(shù)法和Duncan（Duncan's multiple range test）新復(fù)極差法進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）作圖比較。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 不同時期接種對外植體成活的影響

接種時期與培養(yǎng)方式不同，外植材料的成活率也不同，而且引起外植體死亡的因素也不同。處理A與處理B不同時期接種成活率相近，3個時間段平均成活率分別為49.14%和48.58%、77.04%；引起芽死亡的原因也相同，均為褐化（見圖1）。處理C不同時期接種成活率不同，以8月5日成活率最高，其次為10月5日；引起芽死亡的原因主要是材料帶菌（見圖1、2）。經(jīng)差異性分析，處理A與B成活率差異不顯著（Sig=0.86>0.05），處理A、B與處理C成活率差異達(dá)極顯著水平（Sig<0.01）。

圖1 不同處理的外植體成活率

圖2 不同時期接種外植體死亡情況

2.2 不同處理在不同激素水平下對組培苗繁殖的影響

2.2.1 增殖速度 不同激素水平對組培苗的增殖速度影響較大，但同一激素水平對不同處理組培苗的增殖速度影響程度相近（見表1）。試驗結(jié)果表明，組培苗增殖速度最高的為處理A（為2589倍），其次是處理B（297倍），最低為處理C。經(jīng)差異分析，處理間差異達(dá)極顯著水平（Sig<0.01）；6-BA和NAA對甘蔗組培苗增殖培養(yǎng)均具有明顯的效果，其中6-BA與NAA同時存在時，組培苗增殖苗數(shù)較多，6-BA與NNA獨立存在時，6-BA增殖效果遠(yuǎn)高于NAA，在參試培養(yǎng)基中，以6-BA 1.5mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L增殖效果較好。

表1 不同激素水平組培苗快繁情況

2.2.2 組培苗質(zhì)量 以6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L激素配比培養(yǎng)條件下對各處理試管苗質(zhì)量進(jìn)行測定。處理不同，蔗苗質(zhì)量不同（圖3）。假莖高度以處理C最高，為5.56 cm，其次為處理B，為4.53 cm，處理A為4.49 cm，與處理C差異極顯著（Sig<0.01）；各處理葉片長度、假莖粗的表現(xiàn)與假莖高度相同（Sig>0.05）；每瓶苗鮮重，以處理A最高，達(dá)13.7g，其次為處理B，為10.5 g，處理C只有6.3 g，差異極顯著（Sig<0.01）。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，若不及時轉(zhuǎn)接新培養(yǎng)基，處理A部分蔗苗會出現(xiàn)枯黃，處理B、C極少出現(xiàn)此現(xiàn)象。

2.2.3 不同處理對組培苗（不正常苗）生長的影響 甘蔗組培繁殖過程中，絕大部分為生長正常的苗，但也有一小部分為不正常生長的苗。從外觀上分類，本試驗中不正常生長的苗類型有白化苗、細(xì)弱小苗、玻璃化苗、瘋長苗4種情況（見圖4），不正常苗發(fā)生率最高的是處理A，其次為處理B。玻璃化苗各處理之間均未達(dá)到顯著水平（Sig<0.01），但白化苗、細(xì)弱小苗、瘋長苗處理A和處理B與處理C相比都達(dá)到了極顯著水平（Sig<0.01）。

2.3 不同激素水平對組培苗生根及移栽成活率的影響

2.3.1 不同處理不同激素水平對組培苗生根的影響 試驗結(jié)果（見表2）表明，不同處理間組培苗生根差異不顯著，生根率處理A為75.3%，處理B為76.9%，處理C為76.6%。NAA和ABA對甘蔗組培苗生根具有明顯的作用，NAA和ABA單獨使用時，NAA的生根效果好于ABA；NAA和ABA同時一起使用時，兩者對生根具有一定的累加效應(yīng)，但效果不明顯。在16個培養(yǎng)基中，以NAA 7.5mg/L+ABA 2.5mg/L生根率最高，達(dá)95.0%，為最佳生根培養(yǎng)基。

表2 不同激素水平組培苗生根情況

2.3.2 不同處理不同激素水平對組培生根苗室外移栽成活率的影響 將已完全長根的組培苗冼凈后移栽到室外叢栽苗圃，移栽前統(tǒng)計苗根系質(zhì)量情況，結(jié)果見圖5。試驗結(jié)果表明，處理C根系優(yōu)于處理B和處理A，但各處理之間差異不顯著（Sig>0.05），處理B和處理A的根質(zhì)量相似，差異不明顯（Sig>0.05）；3種類型的瓶苗室外移栽成活率均較高（圖6），差異不明顯。

2.4 不同處理對組培苗去除RSD、花葉病的效果

不同處理對組培苗去除RSD、花葉病的效果不同（見表3）。試驗結(jié)果表明，在去除RSD方面，處理A能去除RSD，去除率95%；其次為處理B，RSD去除率為70%；處理C無法去除RSD，與處理A和處理B差異極顯著（Sig<0.01）。

在去除花葉病方面，處理A去除率達(dá)100%；其次為處理B，花葉病去除率為75%；處理C無法去除花葉病，與處理A和處理B差異極顯著（Sig<0.01）。

表3 不同處理試管苗對RSD和花葉病脫毒效果

3 結(jié)論

3.1 不同時期接種對外植體成活的影響

兩種莖尖外植體在不同時間段接種，外植體死亡因素的相同，主要是褐化引起。甘蔗莖尖分生組織接種在培養(yǎng)基上，不到24h就開始陸續(xù)出現(xiàn)褐化，72h后褐化率達(dá)100%。莖尖接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)下暗培養(yǎng)2周左右，未褐化的組織4周長出乳白色致密胚性愈傷組織，小部分褐化較輕的組織也能長出乳白色致密胚性愈傷組織；然后轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培基1周后，逐漸長出米黃色的胚性細(xì)胞團(tuán)進(jìn)而分化出苗，從接種到出現(xiàn)再生苗約需30～40d時間；甘蔗莖尖接種在分化培養(yǎng)基上，褐化情況與甘蔗莖尖愈傷組織培養(yǎng)相似，存活的莖尖40d左右長出綠芽，60d左右分化成叢芽；腋芽外植體接種在分化培養(yǎng)基上，褐化程度較輕，個別較重的對苗的成活影響也不大，因褐化原因沒有引起腋芽死亡，引起腋芽外植體死亡的主要因素是真菌、細(xì)菌污染。腋芽由于有葉組織的保護(hù)及未有損傷，沒有產(chǎn)生褐變，故其成活率較高，產(chǎn)生的污染主要是外植體組織內(nèi)的真菌、細(xì)菌引起，大部分是在培養(yǎng)20d以后陸續(xù)發(fā)生。因此，若用莖尖進(jìn)行脫毒苗繁育，在接種及培養(yǎng)前期，對莖尖進(jìn)行處理，以降低褐化程度，可提高成活率。

3.2 不同處理對組培苗繁殖速度與質(zhì)量的影響

莖尖分生細(xì)胞是種質(zhì)細(xì)胞，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，因此一個莖尖經(jīng)誘導(dǎo)后分化再生較多的植株；而莖尖和腋芽直接分化出苗，以芽繁芽，其繁殖速度較低。在相同的培養(yǎng)條件下，由于不同處理其蔗苗繁殖速度不同，其蔗苗的質(zhì)量也有所不同。本試驗莖尖胚性細(xì)胞苗增殖較快，每瓶苗的數(shù)量較多，平均每株苗的營養(yǎng)、光、氣等條件相對較低，因此其增殖苗相對較細(xì)，且在繁殖過程中因培養(yǎng)中營養(yǎng)不足出現(xiàn)蔗苗枯黃的現(xiàn)象；腋芽苗增殖較慢，平均每株苗的營養(yǎng)、光、氣等條件相對較好，苗較粗壯；莖尖苗質(zhì)量處于莖尖胚性細(xì)胞苗與腋芽苗之間。因此，為提高組培苗質(zhì)量，莖尖胚性細(xì)胞苗在繁殖過程中，適當(dāng)降低每瓶苗的基本苗數(shù)，改善培養(yǎng)條件，并可以提高繁育速度。

3.3 不同處理對組培苗（不正常苗）生長的影響

本試驗組培苗出現(xiàn)的不正常苗有白化苗、細(xì)弱小苗、玻璃化苗和瘋長苗。莖尖胚性細(xì)胞分化長成的苗，4種不正常生長狀態(tài)的苗的發(fā)生率高于莖尖苗和腋芽苗；莖尖苗其不正常苗發(fā)生情況與莖尖胚性細(xì)胞苗相似；腋芽分化的苗，在發(fā)生形態(tài)上是以芽長芽，只有玻璃化苗發(fā)生。4種生長不正常苗在生根試驗中，白化苗、細(xì)弱小苗、玻璃化苗均能正常生根，但玻璃化苗所長根系質(zhì)量較低，而瘋長苗在生根培養(yǎng)基中仍處于增殖狀態(tài)，很少有根的發(fā)生。上述不正常生長苗是否屬于變異正在進(jìn)行研究之中。因此，在組培繁育過程中，適當(dāng)降低激素水平與培養(yǎng)代數(shù)，可減少不正常苗的發(fā)生率。

3.4 不同處理不同激素水平對組培苗生根及移栽成活率的影響

本試驗結(jié)果，同一甘蔗品種不同供體器官，在相同培養(yǎng)繁育條件下，不同處理間組培苗生根率、根系質(zhì)量及室外移栽成活率等差異不顯著。因此，基因型相同的不同供體器官繁殖的組培苗，對生根培養(yǎng)基的反應(yīng)相同。

3.5 不同處理對組培苗去除RSD、花葉病的影響

甘蔗宿根矮化病病原菌和病毒在植物體內(nèi)的傳播有兩種方式，一種是通過胞間連絲傳播，另一種是隨著營養(yǎng)物質(zhì)流在維管束系統(tǒng)傳播。莖尖分生組織生長活躍，且維管束系統(tǒng)尚未形成，宿根矮化病菌和病毒顆粒幾乎不能到達(dá)生長點。因此，莖尖培養(yǎng)脫毒效果與莖尖剝離大小有關(guān)，剝離越小，其脫毒效果越好，但成活率越低。本試驗結(jié)果，甘蔗莖尖胚性細(xì)胞苗與莖尖苗均有去除RSD、花葉病的作用，腋芽苗不能去除RSD、花葉病。

4 討論

莖尖分生細(xì)胞是種質(zhì)細(xì)胞，從理論上看，通過莖尖分生細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性細(xì)胞團(tuán)是一條理想的快繁途徑，可獲得大量的胚狀體及再生植株。本研究表明，利用甘蔗莖尖誘導(dǎo)胚性細(xì)胞團(tuán)分化再生植株，不僅試管苗擴(kuò)繁增殖量遠(yuǎn)高于莖尖快繁和腋芽快繁，無性系變異不明顯，而且其脫毒效果好，能較徹底地去除供體中的甘蔗宿根矮化病和花葉病。因此，甘蔗莖尖體細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性細(xì)胞分化再生植株途徑解決了甘蔗目前脫毒試管苗生產(chǎn)中存在擴(kuò)繁量小、成本高的難題，有利于甘蔗脫毒健康種苗在生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用。

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