紅球菌-R04生物降解多鹵代聯(lián)苯的影響因素研究

楊秀清,鄭 媛,李鵬麗,王婧人 (山西大學生物技術(shù)研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

紅球菌-R04生物降解多鹵代聯(lián)苯的影響因素研究

楊秀清*,鄭 媛,李鵬麗,王婧人 (山西大學生物技術(shù)研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

研究了不同取代元素以及取代元素的數(shù)量、位置等因素對 Rhodococcus sp. R04降解多鹵代聯(lián)苯的影響.結(jié)果表明,聯(lián)苯苯環(huán)第4位上的氫分別被氟、氯、溴以及甲基基團取代后降解率由高到低依次為4-FB＞4-CB≥4-MB＞4-BrB;當取代元素相同時,隨著取代原子數(shù)目的增加,多鹵代聯(lián)苯降解率降低;當取代元素及取代原子數(shù)目相同時,不同位置的取代對鹵代聯(lián)苯的降解影響較大,特別是2,6位取代會強烈抑制關(guān)鍵酶對鹵代聯(lián)苯的催化降解,導(dǎo)致降解率降低.

Rhodococcus sp. R04；降解；多鹵代聯(lián)苯

Abstract：Three influencing factors, including different substituted elements, numbers and position of substituted elements were investigated to correlate structural features to degradation of polyhalogenated biphenyls by Rhodococcus sp. R04. For mono-substituents, degradation preference of R. sp. R04 were in the order 4-FB＞4-CB≥4-MB＞4-BrB. When the substituted elements were same, degradation rates of halogenated biphenyls reduced as halogen substitution increased. The strain was relatively insensitive to the halogen substitution pattern on the biphenyl ring, when halogenated biphenyls containing the same halogen substitution and numbers, the effect of the position of substituted halogen on the degradation of polyhalogenated biphenyls was great, especially 2,6-CB, which intensively showed striking resistance to degradation, eventually led to the reduction of degradation rates.

Key words：Rhodococcus sp. R04；degradation；polyhalogenated biphenyls

鹵代聯(lián)苯具有高度的化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗氧化性、較低的蒸汽壓和良好的電絕緣性,因而曾被廣泛地應(yīng)用于紡織、電子電器、阻燃劑等各種生產(chǎn)領(lǐng)域[1-3].但由于各種鹵代聯(lián)苯具有持久性有機污染物的特征, 由于使用過程中滲漏、排放進入環(huán)境,已造成了長期的大范圍污染[4],因此對鹵代聯(lián)苯的降解已經(jīng)成為了人們十分關(guān)注的問題.目前,處理鹵代聯(lián)苯的方法主要是物理法,化學法及焚燒, 但是這些方法價格昂貴容易產(chǎn)生二次污染,微生物處理具有環(huán)境友好性,經(jīng)濟性等特點被各國廣泛采納[5].

研究表明,微生物降解多氯聯(lián)苯有兩種途徑:厭氧脫氯降解和好氧開環(huán)降解[6].紅球菌Rhodococcus sp. R04與Rhodococcus sp. RHA1,Rhodococcussp. M5, R.erythropolisBD2, R.globerulusP6相似,是一株新的能夠降解鹵代聯(lián)苯的好氧微生物[7-10].本課題組前期利用該菌對幾種多氯聯(lián)苯的降解進行了初步研究[11],結(jié)果表明,菌株R04可以降解一系列不同數(shù)量取代基的多氯聯(lián)苯.

本研究考察了鹵代聯(lián)苯苯環(huán)上不同取代元素和取代元素的數(shù)量、位置對Rhodococcus sp. R04降解能力的影響,以期了解該菌株對幾種鹵代聯(lián)苯的降解機制和機理,為利用微生物進行污染修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株來源 Rhodococcus sp. R04,來源于由中國科學院微生物研究所.

1.1.2試劑 聯(lián)苯購自軍事醫(yī)學科學院試劑站,4-Fluorobiphenyl(4-FB), 4,4′-Difluorobiphe nyl(4,4′- FB), 4-Bromobiphenyl(4-BrB), 4,4′-Dib romobiphenyl (4,4′-BrB), 4-Chlorobiphenyl (4-CB), 4, 4′ -Dichlorobiphenyl (4, 4′-CB), 2-Chloro biphenyl (2-CB), 4-methylbiphenyl (4-MB),2,6-Dichlorobiphenyl (2,6-CB),3-Chlorobiphenyl(3-CB), 3,3′-Dichlorobiphenyl (3,3′-CB)和3,4-Di chlorobiphenyl (3,4-CB)均購自美國Fluka公司,色譜純甲醇購自Dikma公司.

1.1.3培養(yǎng)基 2.93g KH2PO4,5.87g K2HPO4, 0.3gMgSO4, 0.01g FeSO4, 2g NaCl, 5g (NH4)2SO4,微量鹽溶液2mL[10],1L蒸餾水.固體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂,使用時加入0.1%聯(lián)苯作為碳源.

1.2實驗方法

1.2.1菌株的活化及培養(yǎng) 將Rhodococcus sp. R04在涂有0.1%聯(lián)苯的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面劃線,于30℃培養(yǎng)箱放置5d,挑取單菌落接種于含有0.1%聯(lián)苯的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h.

1.2.2鹵代聯(lián)苯溶液的配制 準確稱取/移取一定量的4-FB、4,4′-FB、4-BrB、4,4′-BrB、4-CB、4,4′-CB、4-MB、2-CB、2,6-CB、3-CB、3,3′-CB、3,4-CB、標準試劑溶于N,N′-二甲基甲酰胺中,使其濃度達到40 mmol/L,置于-20℃保存.

1.2.3生物降解多鹵代聯(lián)苯 Rhodococcus sp.R04在含有0.1%聯(lián)苯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng),當OD600達到1.0時,經(jīng)玻璃棉過濾除去聯(lián)苯固體顆粒,6000r/min離心10min收集菌體,30mL磷酸緩沖液(20mmol/L,pH 8.0)洗滌2次,接著以5mL上述緩沖液重新懸浮菌體,測定其OD600值.菌懸液室溫放置2～3小時后加入到含有鹵代聯(lián)苯的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,至培養(yǎng)基中菌體濃度達到OD600值為0.3.每種鹵代聯(lián)苯的終濃度為400μmol/L.

1.2.4鹵代聯(lián)苯的降解分析 鹵代聯(lián)苯降解的HPLC分析按照文獻[12]進行.色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18液相色譜柱(4.6mm× 250mm),流動相為甲醇-水(體積比9:1),流速1.0mL/min,檢測波長為每種鹵代聯(lián)苯的最大吸收波長,柱溫25℃,進樣量為20μL.

樣品的處理和分析:于不同時間取含有鹵代聯(lián)苯的培養(yǎng)液,加入等體積色譜純甲醇,旋渦混合2 min,充分混勻后取1mL離心(12000r/min, 10min),取上清作為待測樣品,每個樣品中加入一定量的內(nèi)標物(3-氯代苯甲酸),混勻后取20μL進行HPLC 分析,用內(nèi)標法[13]計算各樣品中鹵代聯(lián)苯的殘留量.

2 結(jié)果與討論

2.1相同位置上不同取代元素的鹵代聯(lián)苯的降解

將R04的靜息細胞分別加入到含有400μmol/L 4-BrB、4-FB、4-MB,4-CB、4,4′-FB、4,4′-BrB、4,4′-CB的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng),每隔4h分別取樣進行分析.幾種鹵代聯(lián)苯的降解率見圖1和圖2.

由圖1可見,菌株R04可以降解4-BrB、4-FB、4-CB、4-MB,培養(yǎng)4h后其降解率分別為71.18%、98.21%、93.92%、93.22%,培養(yǎng)8h時降解率分別達到了95.75%、100%、100%、100%,但是,4-BrB在20h后才能被完全降解.可見,R04可以快速降解這幾種單鹵代聯(lián)苯.同時,實驗結(jié)果也表明,當聯(lián)苯相同位置上的取代元素不同時,菌株R04對鹵代聯(lián)苯的降解率也不同,當?shù)?位上氫原子分別被鹵族元素氟、氯、溴,以及甲基基團取代后,降解率由高到低依次為4-FB＞4-CB≥4-MB＞4-BrB.由圖2可見,培養(yǎng)4h后菌株R04對4,4′-FB、4,4′-CB、4,4′-BrB的降解率分別為39.2%、29.54%、5.67%,培養(yǎng)20h后, 4,4′-FB完全降解,而4,4′-CB、4,4′-BrB的降解率卻只有50.37%和14.92%.可見,當聯(lián)苯的第4位以及其對位上的氫同時被鹵族元素氟、氯、溴取代后,降解率由高到低依次為4,4′-FB＞4,4′-CB＞4,4′-BrB.

典型的PCBs/聯(lián)苯降解途徑中,聯(lián)苯雙加氧酶催化PCBs降解的第一步反應(yīng),進攻苯環(huán),加入一分子氧,形成二醇,繼續(xù)在脫氫酶作用下形成2,3-二羥基聯(lián)苯,該化合物在2,3-二羥基聯(lián)苯-1,2-雙加氧酶(BphC)的作用下通過間位裂解生成黃色開環(huán)化合物2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸,繼而在2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸水解酶(BphD)的作用下生成氯代苯甲酸或苯甲酸[14].

圖1 菌株 R04對4-CB、4-MB、4-BrB、4-FB的生物降解動力學過程Fig.1 Biodegradation kinetics of 4-CB, 4-MB, 4-BrB, 4-MB and 4-FB by strain R04

圖2 菌株 R04對4,4′-BrB、4,4′-FB、4,4′-CB的生物降解動力學過程Fig.2 Biodegradation kinetics of 4,4′-BrB, 4,4′-FB and 4,4′-CB by strain R04

本實驗中,由于聯(lián)苯/鹵代聯(lián)苯的取代元素不同,因而對上述幾種酶產(chǎn)生的空間位阻也不同,其中,氫原子最小,氟次之,氯第三,溴原子半徑最大,當降解途徑中的一系列酶進攻苯環(huán)時,受鹵族原子阻擋,原子半徑越小所受的阻擋就越小,越有利于酶的進攻,降解率就較高. Bhowmik等[15]也得到了相同的結(jié)論,即取代基的大小會影響降解代謝中關(guān)鍵酶(BphD)的催化速率,其降解難易序列為H＞F＞Cl＞Me. 4-BrB的降解率比4-MB的低,這可能是因為盡管溴原子要比甲基基團半徑小,但是它的毒性有所增加,對細胞的損傷程度增大,從而導(dǎo)致4-BrB降解率比4-MB的低.

2.2相同元素不同數(shù)量的鹵代聯(lián)苯的降解

將R04的靜息細胞分別加入到含有400μmol/L 4-CB、4,4′-CB、4-BrB、4,4′-BrB、4-FB、4,4′-FB的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng),鹵代聯(lián)苯的降解率隨取代個數(shù)的增加而降低(圖1,圖2),當聯(lián)苯上僅4位氫被取代時,培養(yǎng)4h后氟、氯、溴取代的單鹵代聯(lián)苯的降解率都可以達到90%以上,當取代原子增加至2個時,4h后4,4′-FB 的降解率為39.2%, 4,4′-CB的降解率為29.54%,而4,4′-BrB的降解率僅為5.67%,培養(yǎng)20h后,單鹵代聯(lián)苯的降解率都可達到100%,而二鹵代聯(lián)苯中只4,4′-FB的降解率達到了100%.這表明鹵代聯(lián)苯的降解受取代原子數(shù)量的影響.由于單鹵代聯(lián)苯取代原子對降解途徑中每種酶的空間位阻較小,利于其對苯環(huán)的進攻,而當取代原子的數(shù)量增加時,空間位阻就會隨之增大,阻擋了鹵代聯(lián)苯與聯(lián)苯雙加氧酶活性位點結(jié)合因而降解率也會有所下降. Furukawa等[16], Eisenreich等[17], Svobodova等[18]的研究也證實了這一觀點.

2.3同種元素不同取代位置的鹵代聯(lián)苯的降解

將R04的靜息細胞分別入加到含有400μmol/L 2-CB、3-CB、4-CB、3,3′-CB、3,4-CB、2,6-CB 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng),每隔4h取樣進行分析.幾種不同的鹵代聯(lián)苯的降解率如圖3所示,對于單氯聯(lián)苯,受不同位置取代的影響較小,在5h內(nèi),2-CB、3-CB、4-CB的解率分別為100%、89.5%、98.6%,這是因為單氯聯(lián)苯只有一個位置的氫被氯原子取代,降解途徑中各種酶受其空間位阻的影響較小.而對于二氯聯(lián)苯來講,取代位置的不同對降解有較大的影響,培養(yǎng)4h時3,3′-CB、3,4-CB、2,6-CB的降解率分別為91.05%、92.35%、8.64%.

由此可見,菌株R04對二氯聯(lián)苯的降解有很大的差別,這主要是由聯(lián)苯雙加氧酶以及2,3-二羥基聯(lián)苯1,2-雙加氧酶作用機制造成的,它們都是通過進攻苯環(huán)的2,3位之間的鍵作用的.2,6-CB的兩個氯原子都位于另一苯環(huán)的2位附近,嚴重的阻擋了聯(lián)苯雙加氧酶和2,3-二羥基聯(lián)苯1,2-雙加氧酶的作用,所以降解作用較緩慢,但20h后其降解率仍然可達35.74%,這與以往只有很少的菌株能夠降解2,6-CB的研究[19]有所不同.3,4-CB的降解率略高于3,3′-CB,這是由于取代位點集中在一個苯環(huán)上比分布在不同苯環(huán)上的PCBs更易代謝.同時還發(fā)現(xiàn)二氯聯(lián)苯3,3′-CB、3,4-CB的降解率要比單氯聯(lián)苯3-CB的降解率高,這在以往的報道中很少見,Donna等[20]通過幾種不同的菌株對單氯聯(lián)苯、二氯聯(lián)苯的降解實驗也得出了相類似的結(jié)果,其原因可能是由于菌株不同造成的.

圖3 菌株R04對2-CB、3-CB、4-CB、3, 3′-CB、3, 4-CB、2, 6-CB的生物降解動力學過程Fig.3 Degradation kinetics of 2-CB, 3-CB, 4-CB, 3,3′-CB, 3, 4-CB and 2, 6-CB by strain R04

3 結(jié)論

3.1Rhodococcus sp. R04是一株高效降解鹵代聯(lián)苯的菌株,該菌在4h內(nèi)降解90%以上的4-FB、4-CB、4-MB、2-CB等單鹵代聯(lián)苯及3,3′-CB和3,4-CB;對難以降解的2,6-CB,20h后的降解率可達35.74%;對4,4′-BrB,20h后的降解率僅為5.67%.

3.2鹵代聯(lián)苯環(huán)上不同取代元素以及取代元素的數(shù)量、位置對菌株R04的降解影響較大,表現(xiàn)為:苯環(huán)第4位上氫分別被鹵族元素氟、氯、溴以及甲基基團取代后降解率依次為4-FB＞4-CB≥4-MB＞4-BrB;當取代元素相同時,隨著取代原子數(shù)目的增加,降解率減小;不同的取代位置對鹵代聯(lián)苯的降解影響較大,特別是2,6位取代會極大的阻礙菌株R04相關(guān)酶系對其的轉(zhuǎn)化.

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Influencing factor for the biodegradation of polyhalogenated biphenyls by Rhodococcus sp. R04.

YANG Xiu-qing*, ZHENG Yuan, LI Peng-li, WANG Jing-ren (Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Instiute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China). China Enviromental Science, 2010,30(5)：694～698

X172

A

1000-6923(2010)05-0694-05

楊秀清(1975-),男,山西代縣人,副教授,博士,主要從事微生物生物轉(zhuǎn)化與生物催化研究.發(fā)表論文20余篇.

2009-09-08

國家自然科學基金資助項目(30800030)

* 責任作者, 副教授, xiuqyang@sxu.edu.cn