低劑量雙酚A灌胃對(duì)去卵巢小鼠子宮的增生作用

吳建輝，楊榮富，徐瀅雯，王玖玖，劉向云，劉桂明，何桂林，孫祖越

(1.復(fù)旦大學(xué)，上海200433;

2.中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，上海 200032)

研究報(bào)告

低劑量雙酚A灌胃對(duì)去卵巢小鼠子宮的增生作用

吳建輝1，2，楊榮富2，徐瀅雯2，王玖玖2，劉向云2，劉桂明2，何桂林2，孫祖越2

(1.復(fù)旦大學(xué)，上海200433;

2.中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，上海 200032)

目的觀察小鼠經(jīng)消化道途徑給予低劑量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A對(duì)子宮的作用及機(jī)制。方法雌性ICR小鼠切除雙側(cè)卵巢，恢復(fù)性飼養(yǎng)1周，剔除異常個(gè)體后，50只動(dòng)物隨機(jī)分成5組，每組10只動(dòng)物，依次皮下注射(sc)10.0 μg/(kg·d)17β－雌二醇，灌胃(ig)0、20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA，連續(xù)7 d。動(dòng)物每3d稱量體重一次，于最后一次給藥24 h后，陰道涂片檢測(cè)角化上皮細(xì)胞，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取子宮，稱其干濕重，計(jì)算子宮臟器指數(shù)，組織切片，HE染色后利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量子宮上皮高度和宮腔面積。免疫組化法分析子宮雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)。結(jié)果①與對(duì)照組相比，雌二醇和BPA低劑量組動(dòng)物體重增加，BPA中高劑量組動(dòng)物體重?zé)o明顯差異。②陰道涂片結(jié)果顯示，處于動(dòng)情期動(dòng)物數(shù)分別為:對(duì)照組0/10，雌二醇組10/10，BPA低劑量組2/10，BPA中劑量組1/10，BPA高劑量組0/10;③BPA低劑量組動(dòng)物子宮濕重和含水量較對(duì)照組增加，臟器系數(shù)增大，BPA中高劑量組子宮濕重和臟器系數(shù)較對(duì)照組降低明顯(P＜0.05);④病理組織學(xué)及顯微圖像分析結(jié)果顯示，BPA低劑量組動(dòng)物子宮腔面積較對(duì)照組增大，中高劑量組子宮腔面積明顯減小(P＜0.01);低劑量組動(dòng)物子宮上皮高度較對(duì)照組增高(P＜0.01)，中高劑量組子宮上皮高度降低明顯(P＜0.01)。⑤免疫組化結(jié)果顯示，低劑量BPA能增強(qiáng)小鼠子宮ER和PR表達(dá)，但隨劑量增加，ER表達(dá)下降。結(jié)論BPA經(jīng)消化道途徑給予ICR小鼠，人環(huán)境暴露劑量下具有雌激素活性，但雌激素活性隨BPA劑量增大呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

雙酚A(BPA);雌激素活性;子宮;小鼠

雙酚A(BPA)是制造聚碳酸脂、環(huán)氧樹脂等的前體物，廣泛應(yīng)用于食品包裝、飲料容器等日常生活塑料制品的生產(chǎn)，可通過食品包裝容器或塑料薄膜滲入食品或飲料進(jìn)入人體。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，認(rèn)為具有弱的雌激素活性，系環(huán)境雌激素的一種［1］。目前對(duì)BPA是否具有胚胎毒性還存在爭(zhēng)議，但一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證示BPA對(duì)雄性生殖系統(tǒng)具有直接毒性作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尤其提示環(huán)境暴露劑量下，BPA可能對(duì)男性生殖系統(tǒng)存在較為明顯毒性作用［2－4］。綜合目前已公開報(bào)道的有關(guān)BPA雌激素活性的文獻(xiàn)，BPA的給予方式主要包括:體外直接作用于細(xì)胞;皮下注射大劑量給予動(dòng)物［5］;或整體大劑量給予動(dòng)物，最高劑量達(dá)800 mg/kg［6］，結(jié)論均認(rèn)為BPA雌激素活性隨劑量增加而增強(qiáng)。日常生活中，人體主要通過消化道途徑接觸BPA，環(huán)境暴露BPA的劑量為1 μg/kg［7］。在這種低劑量暴露情況下，BPA的雌激素活性如何?是否也呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系?目前尚無(wú)文獻(xiàn)對(duì)BPA低劑量狀態(tài)的雌激素活性進(jìn)行探討。新近的研究報(bào)道提示，低劑量的BPA具有雄性生殖毒性，尤其表現(xiàn)為對(duì)前列腺的影響，這種毒性表現(xiàn)是否與低劑量BPA異常雌激素活性有關(guān)?本文旨在探討模擬人體環(huán)境暴露途徑情況下，低劑量BPA的雌激素活性及原因，為進(jìn)一步探討B(tài)PA與前列腺增生關(guān)系研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

ICR雌性小鼠，體重18～20 g，購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK(滬)2007－0005］。

1.2 藥物

雙酚A(bisphenol A)，含量95%，批號(hào)162k0715，Sigma公司生產(chǎn)，以0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)均勻分散供試品;17β－雌二醇(17βestradiol)，含量97%，批號(hào)23607072，Sigma公司生產(chǎn)，橄欖油溶解。

1.3 儀器

PM 600型電子天平，Switzerland產(chǎn);BH－2型顯微鏡，日本Olympus公司;Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件，Motic中國(guó)有限公司。

1.4 動(dòng)物處理及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，麻醉狀態(tài)下切除雙側(cè)卵巢，恢復(fù)性飼養(yǎng)1周，連續(xù)5 d作陰道涂片，剔除出現(xiàn)動(dòng)情反應(yīng)的個(gè)體。符合要求的動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組，依次分設(shè)對(duì)照組、雌二醇組和BPA低、中、高三個(gè)劑量組，每組10只動(dòng)物。雌二醇組動(dòng)物皮下注射10.0 μg/(kg·d)17β－雌二醇，BPA組動(dòng)物依次灌胃給予20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA，連續(xù)7 d，對(duì)照組動(dòng)物灌胃給予等體積溶媒。動(dòng)物每3d稱量體重一次，于最后一次給藥24 h后，陰道涂片檢測(cè)角化上皮細(xì)胞，染色拍照，頸椎脫臼處死動(dòng)物。

1.5 子宮病理組織學(xué)觀察及上皮高度與子宮腔面積分析

取子宮，修去子宮周圍脂肪，稱其濕重，計(jì)算子宮臟器系數(shù)，其中一半子宮組織置80℃干燥24h后，稱量干重，另一半子宮組織置10%福爾馬林溶液固定，病理切片，HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮形態(tài)學(xué)變化，并利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量子宮內(nèi)膜上皮高度和子宮腔面積。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)

子宮組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定后，石蠟包埋，4 μm切片，按武漢博士德生物工程有限公司提供的試劑盒使用說明，SABC免疫組化法檢測(cè)子宮組織ER和PR受體表達(dá)，其中，ER和PR抗體按1∶100稀釋。每組選6個(gè)標(biāo)本，每張組織切片觀察5個(gè)視野，利用圖像分析軟件分析平均吸光度值，分析ER和PR的表達(dá)程度。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

借助SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)后，再進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 給予BPA后ICR小鼠體重變化

去勢(shì)ICR小鼠恢復(fù)性飼養(yǎng)一周后，灌胃給予BPA，各組動(dòng)物平均體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中，雌二醇組動(dòng)物體重增長(zhǎng)最為明顯，至給藥后第8天，BPA低劑量組動(dòng)物平均體重高于中高劑量BPA組和對(duì)照組，BPA中劑量組動(dòng)物平均體重略低于對(duì)照組(圖1)。

2.2 BPA對(duì)ICR小鼠動(dòng)情周期影響

ICR小鼠給予BPA 7 d后，陰道涂片經(jīng)Giemsa染色，顯微鏡下觀察顯示，處于動(dòng)情期的ICR小鼠數(shù)量隨BPA劑量增加而減少，雌二醇組動(dòng)物均處于動(dòng)情期，對(duì)照組動(dòng)物多數(shù)處于動(dòng)情后期和動(dòng)情間期(表1)。

圖1 BPA對(duì)去勢(shì)ICR雌性小鼠體重影響Fig.1 Effects of BPA on the body weight of ovariectomized female ICR mice

表1 BPA對(duì)去勢(shì)ICR小鼠動(dòng)情周期影響(n=10)Tab.1 Effects of BPA on estrous cycle of ovariectomized ICR m ice(n=10)

2.3 BPA對(duì)ICR小鼠子宮重量及含水量影響

ICR小鼠給予BPA后，低劑量組動(dòng)物子宮平均重量和組織平均含水量增加，臟器系數(shù)增大，與雌二醇組相當(dāng)。隨BPA劑量增加，動(dòng)物子宮重量和子宮臟器系數(shù)降低(P＜0.05)，子宮組織平均含水量降低(表2)。

表2 BPA對(duì)去勢(shì)ICR小鼠子宮重量及含水量影響(x±s，n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s，n=10)

表2 BPA對(duì)去勢(shì)ICR小鼠子宮重量及含水量影響(x±s，n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s，n=10)

注:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.對(duì)照組Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with the control group.

組別Group體重(g) Body weight子宮重量(g) Uterus weight含水量(/100) Uterus water content(/100)臟器系數(shù)(/100) Organ coefficient(/100)對(duì)照組Control group 27.5±2.4 0.11±0.02 79.9±5.7 0.41±0.10雌二醇組E2 group 31.2±1.5**0.18±0.03**81.0±3.1 0.59±0.11**BPA低劑量20 μg/kg BPA 28.5±2.2 0.15±0.04 80.9±2.6 0.52±0.15 BPA中劑量60 μg/kg BPA 27.2±3.0 0.07±0.04*58.9±13.1*0.26±0.13*BPA高劑量180 μg/kg BPA 27.7±2.1 0.08±0.01*74.7±11.4 0.28±0.05*

2.4 BPA對(duì)ICR小鼠子宮形態(tài)學(xué)影響

去勢(shì)ICR小鼠給予BPA 7 d后，BPA低劑量組動(dòng)物子宮腔面積增大，子宮上皮增生明顯(P＜0.01)，而BPA高劑量組動(dòng)物子宮腔面積縮小(P＜0.01)，子宮上皮萎縮。鏡下顯示，BPA低劑量組子宮腔內(nèi)上皮增生突出，隨BPA劑量增加，子宮腔面積縮小，子宮上皮萎縮。見表3，圖2(見彩插9)。

表3 BPA對(duì)去勢(shì)ICR小鼠子宮腔及子宮上皮高度影響(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

表3 BPA對(duì)去勢(shì)ICR小鼠子宮腔及子宮上皮高度影響(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

注:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.對(duì)照組Note:*P＜0.05，**P＜0.01，compared with the control group.

組別Group子宮腔面積Area of Uterine cavity (n=10，μm2)子宮上皮Height of Endometrium (μm，n=50)對(duì)照組Control group 20 224±6 395 3.35±0.77雌二醇組E2 group 17 569±5 856 5.65±0.78**BPA低劑量20 μg/kg BPA 23 004±7 668 4.85±0.77**BPA中劑量60 μg/kg BPA 4 091±1 446**2.63±0.77 BPA高劑量180 μg/kg BPA 735±245**1.97±0.48**

2.5 BPA對(duì)ICR小鼠子宮雌、孕激素受體(ER、PR)表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，給予BPA后，ICR小鼠子宮ER表達(dá)有一定程度增加，但隨劑量增加下降。PR表達(dá)較對(duì)照組增加明顯，以低劑量組最為明顯。見表4，圖3、4(見彩插10)。

表4 BPA對(duì)ICR小鼠子宮雌、孕激素受體(ER、PR)表達(dá)的影響((x±s，n=6)Tab.4 Effects of BPA on the expression of ER and PR in the ovariectomized ICR m ice(x±s，n=6)

3 討論

良性前列腺增生癥(BPH)是一種多發(fā)于中老年男性的常見疾病，并隨著年齡增大發(fā)病率升高。BPH病因復(fù)雜，其中雌激素介入BPH的發(fā)病過程，而且低劑量的雌激素能夠促進(jìn)BPH發(fā)生［8，9］。BPA作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，經(jīng)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化后，其雌激素活性增高［10］。由于BPA雌激素活性的存在，無(wú)法排除其與BPH存在一定聯(lián)系。

本次研究中，去勢(shì)ICR小鼠灌胃給予20 μg/ (kg·d)BPA一周，7/10的動(dòng)物處于動(dòng)情期和動(dòng)情后期，動(dòng)物平均體重高于對(duì)照組，并且動(dòng)物子宮平均重量和含水量增加，子宮臟器系數(shù)增大。鏡下觀察結(jié)果顯示，低劑量BPA組動(dòng)物子宮腔面積增大，子宮上皮增生明顯。但隨著BPA劑量的逐步增大，其增生作用逐漸減弱。研究表明20 μg/(kg·d)的BPA在生物體內(nèi)具有雌激素活性，并且在三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組中，雌激素活性最強(qiáng)。根據(jù)免疫組化結(jié)果，20 μg/(kg·d)BPA組動(dòng)物子宮ER和PR受體表達(dá)增高，當(dāng)BPA劑量增大至9倍后，小鼠子宮組織ER的表達(dá)低于對(duì)照組。

BPA能夠與ER受體結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)激活雌激素反應(yīng)相關(guān)基因，產(chǎn)生雌激素活性［11］。小鼠暴露于20 μg/(kg·d)BPA(低于人類孕婦的暴露水平)，其雌激素活性的增強(qiáng)可能通過誘導(dǎo)ER和PR表達(dá)增加而達(dá)到。由于BPA能夠與雄激素亞型受體結(jié)合［12］，隨著BPA劑量增加，雄激素活性的表達(dá)增強(qiáng)，在一定程度上可能削弱雌激素對(duì)子宮的增生作用，從而導(dǎo)致子宮隨BPA劑量增加而呈萎縮趨勢(shì)。至于其具體通過何種機(jī)制導(dǎo)致雌激素活性隨BPA劑量增加而降低，需要進(jìn)一步探討。

(本文圖2見彩插9，圖3、4見彩插10)。

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Proliferative Effect of Intragastrically Adm inistered Low Dose Bisphenol A on the Uterus in Ovariectom ized M ice

WU Jian－h(huán)ui1，2，YANG Rong－fu2，XU Yin－wen2，WANG Jiu－jiu2，LIU Xiang－yun2，LIU Gui－m ing2，HE Gui－lin2，SUN Zu－yue2
(1.Fudan university，Shanghai 200433，China. 2.Department of Pharmacology and Toxicology of Shanghai Institute of Planned Parenthood Research. National Evaluation Center for the Toxicology of Fertility Regulation Drugs，Shanghai 200032)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of low dose bisphenol A(BPA)，a xenoestrogen，given by gastric lavage，on uterus of female mice.M ethods Ovariectomized female ICR mice were bred for one week observation and excluding unqualified animals.50 mice were random ly divided into 5 groups，10 animals per group.The m ice were administered 10.0 μg/(kg.d)17β－estradiol(E2)by subcutaneous injection and 0，20.0，60.0 or 180.0 μg/ (kg.d)BPA via intragastric gavage for 7 days.The body weight was monitored every 3 days，vaginal smears were examined by cytology，and the animals were killed at 24 hours after the last treatment.The uterus was removed to measure the wet weight，water content，and to calculate the organ coefficient.The height of endometrial epithelial cells and luminalarea were analyzed with a micro－image analysis system(M IVNT).The expression of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)of uterus were analyzed by immunohistochemistry.Results①Compared with the control，the mean animal body weights of mice of the E2group and low dose BPA group were increased，while there were no significiant differences between mid and high dose BPA groups and control.②Based on cytological data of vaginal smear，animal number in estrus were:0/10 in control group，10/10 in E2 group，2/10 in low－dose BPA group，1/10 in mid－dose BPA group，and 0/10 in high－dose BPA group.③Compared with the control group，the uterus weight，water content and organ coefficient in the low－dose BPA group were increased，while those of mid－and high－dose BPA groups were significantly decreased(P＜0.05).④According to the data of histopathology and MIVNT，compared with the control，the uterine luminal area in the low－dose BPA group was significantly enlarged，and the height of endometrial epithelial cells was increased(P＜0.01)，while in the mid－and high－dose BPA groups，the luminal area was decreased(P＜0.01)，and the height of endometrial epithelial cells was decreased(P＜0.01).⑤The immunohistochemical data showed that compared with the control group，the ER and PR expressions in the low－dose BPA group were increased，while in the m id－and highdose BPA groups，the expression of ER was decreased，but there were no significant differences.ConlusionA per os intake of BPA at a dose of 20 μg/(kg.d)，a dosage below human daily intake，may promote uterine proliferation in female m ice.But this estrogenic activity is decreasing alone with an increasing dose of BPA.

Bisphenol A(BPA)，Estrogenic activity，Uterus，Mice，female

R994.6

A

1005－4847(2010)02－0145－04

2009－08－05

上海市科委“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究項(xiàng)目(編號(hào):09140900500)。

吳建輝(1976－)，男，助理研究員，博士研究生，研究方向:男性生殖健康及前列腺疾病治療藥物藥理毒理學(xué)研究。Tel:021－64438949，E－mail:wwjh_731@yahoo.com.cn。

孫祖越，E－mail:sunzy64@163.com.