半夏炮制前后HPLC圖譜的比較

鄒菊英 ，陳勝璜 ,2*，雷 昌 ，劉蓓蓓

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

半夏Pinellia ternate Thunb Berit，為天南星科半夏屬植物，其塊莖入藥，主要產(chǎn)于四川、云南、貴州、陜西、河南等省[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有幾千年的用藥歷史，其性溫，味辛，有小毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰，降逆止咳，消痰散結(jié)的功效[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：半夏還具有抗腫瘤、抗生育、降血脂、護(hù)肝和治冠心病等多種重要的作用[3]?；瘜W(xué)成分含鳥苷、腺苷、膽堿、鹽酸麻黃堿、半夏淀粉75.74%，生物堿β-吉甾醇、葡萄糖等，胡蘿卜苷、草酸鈣、半夏蛋白、氨基酸、脂肪酸、無機(jī)元素、半夏胰蛋白酶、抑制物、膽堿等[4-5]。生半夏經(jīng)炮制后刺激性、毒性減小，成分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。但其刺激性、毒性成分具體是什么尚不清楚。本研究采用HPLC方法分析生半夏與法半夏化學(xué)成分，為下一步探討半夏炮制后化學(xué)成分、刺激性、毒性成分提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（四元泵，VWD檢測器，安捷倫化學(xué)工作站）；KQ5200型超聲清洗器（KH，200W，昆明市超聲有限公司）。0.54μm微孔濾膜，電子天平。

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑都為分析純。

1.3 材料

生半夏：經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定為天南星科多年生草本植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 法半夏的炮制

取半夏，大小分開，用水浸泡至內(nèi)無干心，另取甘草適量，加水煎煮2次，合并煎液，倒入用適量水制成的石灰液中，攪勻，加入上述已浸透的半夏，浸泡，每日攪拌1～2次，并保持浸液pH 12以上，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時取出，洗凈，陰干或烘干，即得。每100 kg凈半夏用甘草 15 kg，生石灰 10 kg[6]。

2.2 樣品溶液的制備

精密稱取半夏藥材(干燥，粉碎，過60目篩)1.0 g，置50 mL錐形瓶中，精密加人30 mL 30%甲醇，超聲提取30 min，冷卻后補(bǔ)足失重，過濾，精密量取5 mL濾液，過0.45μm微孔濾膜，備用。25 mL依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取數(shù)次，分別濃縮成浸膏，浸膏加一定體積的30%甲醇溶解，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件

VP-ODS C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，0.01%磷酸水∶乙腈從 0 min(100∶0) 到 45 min(50∶50)線性梯度洗，流速為1.0 mL／min，檢測波長為 260 nm，進(jìn)樣量 10μL，柱溫為30℃。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一半夏制備的供試品溶液，連續(xù)5次進(jìn)樣檢測，測定HPLC圖譜。結(jié)果表明該方法精密度良好，色譜峰1～4相對保留時間 RSD分別為0.13%、0.12%、0.18%、0.23%，相對峰面積 RSD分別為0.98%、1.32%、1.36%、1.48%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取半夏粉末 1.0 g，精密稱定，按“2.2”方法制備供試品溶液。 于 0、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣檢測，結(jié)果表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好，色譜峰1～4相對保留時間 RSD分別為0.08%、0.12%、0.20%、0.18%，相對峰面積 RSD分別為0.19%、0.23%、1.58%、1.90%。

2.6 重復(fù)性考察

取同一批號半夏藥材5份，精密稱定，按“2.2”方法制備供試品溶液，分別檢測，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好,色譜峰 1～4相對保留時間 RSD分別為 0.11%、0.17%、0.21%、0.19%，相對峰面積 RSD分別為 0.78%、1.32%、2.11%、1.89%。

2.7 各供試品 HPLC圖譜測定

取各供試品分別進(jìn)樣，得到各供試品HPLC譜圖。

2.8 結(jié)果

生半夏與法半夏30%甲醇總提液HPLC譜圖見圖1；生半夏與法半夏正丁醇萃取層HPLC譜圖見圖2；生半夏與法半夏乙酸乙酯萃取層HPLC譜圖見圖3；生半夏與法半夏30%甲醇萃取層HPLC譜圖見圖4。

圖2 生半夏與法半夏正丁醇萃取層HPLC圖

圖4 生半夏與法半夏30%甲醇萃取層HPLC圖

3 討論

3.1 樣品處理方法的考察

考察了超聲、回流提取等方法，其中超聲提取的樣品圖譜雜質(zhì)干擾少、色譜峰基線分離好，并且此法操作簡單，提取時間較短，省時節(jié)能，故選用超聲提取法提取。

3.2 色譜條件的選擇

在檢測波長選擇中,有文獻(xiàn)報道選擇260 nm、254 nm作為半夏指紋圖譜的檢測波長[7]。本實(shí)驗(yàn)選用 260 nm和254 nm作雙波長檢測,結(jié)果表明在260 nm處各色譜峰峰形較好,色譜信息較為豐富,分離度也較好。故選260 nm作為檢測波長。流動相的選擇，考察了乙腈-水，甲醇-水，0.01%磷酸水-乙腈等多種流動相的梯度洗脫，結(jié)果顯示0.01%磷酸水-乙腈峰形較好。

3.3 生半夏與法半夏HPLC圖譜分析

本研究采用HPLC法對半夏炮制前后藥材的圖譜進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡單、重復(fù)性好，為研究半夏藥材炮制前后化學(xué)成分變化提供了參考。通過對比生半夏與法半夏30%甲醇總提液HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)生半夏經(jīng)炮制后既有化學(xué)成分量的變化，更存在內(nèi)在成分質(zhì)的改變。進(jìn)一步研究，分別比較正丁醇萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和30%甲醇萃取部分的HPLC圖譜，確定不同成分所在的部位。HPLC圖譜顯示各萃取部分也有成分的變化，特別是30%甲醇部分，法半夏與半夏成分變化很明顯。這說明炮制對藥材質(zhì)量和成分會產(chǎn)生一定的影響，而炮制后新產(chǎn)生組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其與功效改變的關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

[1]李忠紅，劉德培，杜冠華.阜獻(xiàn)產(chǎn)半夏質(zhì)量研究[J].中草藥，2005，36（6）：9 042-9 071.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：110-111.

[3]汪 蕾,張繼振.天南星屬植物研究進(jìn)展[J].延邊大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,30(1)：66-73.

[4]趙 嵐.半夏培養(yǎng)物與人工栽培半夏生物堿類成分對比分析[J].中國中藥雜志,1990,15(3)：18.

[5]杜貴友,放 賢.有毒中藥現(xiàn)代研究與合理應(yīng)用[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2000：413-414.

[6]高昌琨，吳 瓊，張陸軍.半夏及炮制品對動物黏膜刺激性比較[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，20(6)：49-50.

[7]文 燕,張 明,廖志華，等.半夏藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2008，31（4）：503-506.