鈣調神經磷酸酶基因多態(tài)性與中國北方地區(qū)漢族男性心臟功能表型的關聯(lián)性研究

何子紅,胡 揚,李燕春,包大鵬,劉 剛,席 翼,文 立

鈣調神經磷酸酶基因多態(tài)性與中國北方地區(qū)漢族男性心臟功能表型的關聯(lián)性研究

何子紅1,胡 揚2,李燕春2,包大鵬2,劉 剛2,席 翼3,文 立4

目的:探討鈣調神經磷酸酶的5個編碼基因(PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC、PPP3R1和PPP3R2)的55個單核苷酸多態(tài)性與心臟功能表型的初始值及耐力訓練效果的關聯(lián)性。方法:102名無訓練史的青年健康男子完成18周有氧耐力訓練,測試訓練前后的安靜、次最大負荷(50W、100W和150W)下及恢復期的心臟結構及功能指標,采用PCR-RFLP和MALDI-TOF MS對多態(tài)性進行分型,所有的統(tǒng)計學分析均進行多重比較的修正。結果:1) rs3763679(PPP3CA)與安靜時的心率初始值關聯(lián);2)rs1879793、rs1075534、rs7430、rs2461483和rs10108011(PPP3CC)與恢復期的每搏量或/和心輸出量的訓練敏感性關聯(lián); 3)rs1407877(PPP3R2)與次最大負荷(50W)下的射血分數(shù)的訓練敏感性關聯(lián)。結論:鈣調神經磷酸酶基因多態(tài)性可能部分解釋心臟功能指標的個體差異性。

心功指標;耐力訓練;關聯(lián)研究

前言

鈣調神經磷酸酶(Calcineurin,CaN)是鈣依賴信號通道最重要的組成部分,在調控心臟功能過程中有重要作用[4,22,24],尤其在調控心臟肥大方面。比如,CaN缺失的小鼠是可育的,可以正常發(fā)展到成年,但是心臟CaN活性降低80%,心臟大小降低12%,并且CaN缺失的小鼠對于外界刺激引起的心肌肥大反應能力嚴重損害[4]。CaN高表達的轉基因大鼠的心臟較非轉基因大鼠的心臟明顯增大。組織結構分析表明,左心室心室壁剖面和室間隔增厚,右心室和動脈腔也擴大,心肌細胞明顯肥大。左心室壁肌細胞橫截面積的測量表明,轉基因鼠的面積是對照組的2倍[25]。由過氧化物酶體激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptorβ,PPARβ)誘導的快速心肌細胞擴張是由CaN介導的,CaN直接作用在PPARβ的啟動子增強其表達[23]。在動物模型,PPARβ對心臟功能及心臟重量的短期作用與長期訓練引起的作用類似[23]。因此,CaN可能在心肌細胞充當一個內部負荷感受器的作用,匹配心臟生長的需求。

CaN是由催化亞基(calmodulin-binding catalytic A subunit,CnA)和調節(jié)亞基(calcium-binding regulatory B subunit, CnB)組成的異型二聚體,幾乎在所有的組織均有分布。CnA有三種異構體,CnAα、CnAβ和CnAγ,分別由PPP3CA,PPP3CB和PPP3CC基因編碼。CnB有CnB1和CnB2 2種異構體,分別由PPP3R1和PPP3R2基因編碼。PPP3R1的I/D多態(tài)性被報道與高血壓病人[20]和運動員[1]的心臟肥大關聯(lián)。但目前還沒有關于CaN基因型與心臟功能指標對于耐力訓練適應方面的研究。因此,本研究擬探討PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC、PPP3R1和PPP3R2基因的55個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與心臟結構及功能指標的訓練前的初始值及18周(w)耐力訓練的效果的關系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

102名中國武裝警察某部的新兵,籍貫為山東和安徽等北方平原地區(qū),全部為健康男性,漢族。所有士兵入伍前均無訓練史,也無由于生活環(huán)境而導致的長期耐力性活動,排除由此給訓練初始水平造成的差異,平均年齡19± 1歲,身高171.7±5.8 cm,體重60.27±6.54 kg,所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 有氧訓練計劃

5 000 m有氧勻速跑,每周3次,共18周。強度通過個體無氧閾強度(VT)對應的心率(Hr)控制,由polar表(芬蘭)監(jiān)控(VTHr±3)。前10周為95%個體VTHr,后8周為105%個體VTHr。正式訓練前進行2周適應性訓練。實驗期間,受試者作息時間、飲食條件、訓練安排均保持一致。本訓練之外不再進行耐力訓練,只進行一般的力量和軍事訓練,訓練地點在部隊駐地。

1.2.2 心臟功能結構及功能指標的測定

運動方式為臥式蹬車的極限下遞增定量負荷運動。受試者身著單衣單褲,靜臥10 min,然后開始蹬車。取其平臥位,首先測定安靜時左心室結構指標,然后以起始負荷50 W和60 r/min的頻率開始蹬車,每3 min增加負荷50 W,直至150 W蹬滿3 min后停止,總負荷時間9 min。平臥恢復3 min。測定50 W、100 W、150 W負荷的最后30 s和恢復的最后30 s的左心室結構指標。測試地點在有氧訓練駐地,每名受試者兩次測試中的時相(上午、下午、晚上)保持一致,全部測試由同一名實驗師完成。

采集的指標有:左室舒張末內徑(LVDD)、左室收縮末內徑(LVSD)、左室舒張末后壁厚度(PWD)、左室收縮末后壁厚度(PWS)、室間隔舒張末厚度(IVSD)、室間隔收縮末厚度(IVSS),超聲心動儀為Aloka SSD-118型(日本)。

衍生的指標有:1)體表面積bsa=0.006×身高(cm)+ 0.0128×體重(kg)-0.1529;2)每博輸出量指數(shù)SVI(ml/ m2)=(LVDD3-LVSD3)/bsa;3)心輸出量指數(shù)COI(l/m2) =(SV×HR)/bsa;4)射血分數(shù)EF=(LVDD3-LVSD3)/ LVDD3×100%;5)左室重量指數(shù)LVMI(g/m2)=1.04× [(LVDD+PWD+IVSD)3-LVDD3]-14[5]。

獲取的所有數(shù)據(jù)包括:1)結構指標:訓練前后的LVDD、LVSD、PWS、PWD、IVSD、IVSS;2)每搏量指標:訓練前后的SVI、50 W/SVI、100 W/SVI、150 W/SVI、Re/ SVI;3)心輸出量指標:訓練前后的COI、50 W/COI、100 W/COI、150 W/COI、Re/COI;4)射血分數(shù)指標:訓練前后的EF、50 W/EF、100 W/EF、150 W/EF、Re/EF;5)心率指標:訓練前后的HR、50 W/HR、100 W/HR、150 W/HR、Re/HR[7]。

1.2.3 基因多態(tài)性分析

1.2.3.1 單核苷酸多態(tài)性的選擇

PPP3CA全長約323.8 kbp,PPP3CB全長約59.14 kbp,PPP3CC全長約100 kbp,PPP3R1全長約73.66 kbp, PPP3R2全長約3.385 kbp。上下游各擴展2kb后,從hapmap網(wǎng)站(www.hapmap.org)下載上述5個基因(中國北京漢族人)的SNPs,應用haploview軟件中的Tagger程序,根據(jù)pair-wise方法,最小r2=0.8,Maf≥0.1可選擇出55個標簽SNPs(tagSNPs):34個位于PPP3CA,3個位于PPP3CB,12個位于PPP3CC,3個位于PPP3R1和3個位于PPP3R2[8]。

1.2.3.2 單核苷酸多態(tài)性的分型

Promaga公司試劑盒提取全血DNA。rs12644采用PCR-RFLP分析。其他位點采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)分析[27,28]。MALDI-TOF MS是國際通用的基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的研究平臺,也是國際HapMap計劃指定實施平臺之一(http://www.hapmap.org/downloads/assay-design_protocols.html)。

PCR引物和單堿基延伸引物都是用Assay Designer (Sequenom)軟件包設計。所有需要分型的DNA樣本都稀釋到5 ng/μl,取1μl DNA樣本,將其與0.95μl水、0.625 μl PCR緩沖液(含15 mM MgCl2)、1μl的2.5 mM dNTP、0.325μl的25 mM MgCl2、1μl PCR引物以及0.1μl Hot-Star Taq酶(Qiagen)混合在一起。PCR反應條件:94℃15min;94℃20 s,56℃30 s,72℃1 min,共45個循環(huán);最終72℃3 min。PCR擴增后,剩余的dNTP將被去磷酸消化掉,反應體系包括1.53μl水、0.17μl SAP緩沖液、0.3單位堿性磷酸酶(Sequenom)。該反應在37℃進行40 min,然后85℃5 min使酶失活。堿性磷酸酶處理后,針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中進行:0.755μl水、0.2 μl 10X iPLEX緩沖液、0.2μl終止混合物、0.041μl iPLEX酶(Sequenom)和0.804μl 10μM的延伸引物。單堿基延伸反應在下列條件下進行:94℃30 s;94℃5 s,52℃5 s, 80℃5 s5個循環(huán),共40個循環(huán);最后72℃3 min。在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽,混合后加入25μl水懸浮。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom)將最終的分型產物點樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上,并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分析。最終結果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)實時讀取,并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號3.4)完成基因分型分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用χ2檢驗進行H-W平衡檢驗。對于多態(tài)性與初始值的關聯(lián)關系采用單因素方差分析,對于與訓練敏感性的關聯(lián)關系采用重復測量的雙因素方差分析(基因型×訓練)。多重比較采用修正的P值[6,9],所有統(tǒng)計均在SPSS 13.0上完成。

2 研究結果

18周耐力訓練引起心臟結構和功能指標以及最大攝氧量等指標的顯著性變化(表1)[7]?；蛐头中统晒β蕿?6.41%。rs12639641(χ22=5.26,P=0.02),rs2850983 (χ22=4.62,P=0.03)和rs13271367(χ22=13.9,P< 0.001)基因型分布不符合H-W平衡,不進行統(tǒng)計學分析。

表1 本研究對象訓練前、后心臟結構及功能指標及有氧能力的變化一覽表Table 1 Pre-training and Post-training Comparison of Cardiac and Aerobic V ariables in the Total G roup of Subjects

統(tǒng)計學分析進行多重比較的修正后表明:1) rs3763679(PPP3CA)與安靜時的心率初始值顯著關聯(lián)(顯著的基因型作用,表1);2)rs1879793、rs1075534、rs7430、rs2461483和rs10108011(PPP3CC)和恢復期的每搏量或/和心輸出量的訓練敏感性關聯(lián)(顯著的基因型×訓練交互作用,表2);3)rs1407877(PPP3R2)與50W/EF的訓練敏感性關聯(lián)(顯著的基因型×訓練交互作用,表3)。因為數(shù)據(jù)量具大,為了簡單的目的,表2和表3僅列出了P<0.05的位點,之所以將所有P<0.05的位點都列出來是希望給對該基因感興趣的其他研究者更多的啟示。

表2 本研究與訓練前心臟功能指標初始值陽性關聯(lián)的多態(tài)性位點一覽表Table 2 The Association SNPs with Baseline(pre-training)Variables

續(xù)表2

表3 本研究與心臟功能指標訓練敏感性陽性關聯(lián)的多態(tài)性位點一覽表Table 3 The Association SNPs with Training Response V ariables

3 討論

本研究主要的新結果是觀察到CaN編碼基因的多態(tài)性與心臟功能指標的初始值及在次最大負荷運動下及恢復的訓練敏感性關聯(lián)。

PPP3CB基因的rs3763679多態(tài)性與訓練前的安靜狀態(tài)下的心率關聯(lián)。安靜心率是心血管疾病和各種原因死亡的一個危險因素[11]。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)PPP3CC基因的多態(tài)性與Re/COI和/或Re/SVI的訓練敏感性關聯(lián), PPP3R2與次最大負荷下(50W)的EF的訓練敏感性關聯(lián)。CO、SV和EF是體現(xiàn)心臟功能的重要指標,也是其他重要運動相關表型,比如最大及次最大耗氧量和血壓的中間表型[2]。證實對耐力訓練反應的“心臟有利基因型(cardiac favourable genotypes)”,即通過訓練可以使心臟功能獲得最大收益的基因型,對臨床應用也有重要的潛在意義[15,19]。在這同一研究對象中,我們報道過血紅素氧化酶I(heme oxygenase-1,HMOX-1)基因與心臟功能的初始值關聯(lián),但與訓練敏感性不關聯(lián)[7]。相反的,本研究CaN主要是影響心臟功能相關指標的訓練敏感性。另一方面,本研究發(fā)現(xiàn),CaN多態(tài)性主要與心臟功能指標恢復期的訓練敏感性關聯(lián),這并不降低我們研究結果的意義。心臟和血液動力學變量運動后的反應對預測心血管疾病和死亡率有重要價值[26]。

PPP3CC和PPP3R2基因主要在睪丸和大腦表達[13,14]。對于PPP3CC主要在睪丸表達,但影響心臟功能可假定為它影響睪酮水平。實際上,男子的睪酮水平與心臟功能表型及心臟疾病相關[3]。反過來講,PPP3CC可能能夠調控男子血睪酮水平(用過鈣調神經磷酸酶抑制劑后,循環(huán)的睪酮水平降低)[21]。CaN介導的信號轉導途徑是Ca2+誘導的三條主要信號通道中最重要的一條,激活的CaN直接對核因子的活化T細胞(nuclear factor of activated T cells,NFAT)去磷酸化,并且轉移到核內,誘導相關肥大基因的表達[18,22,24]。它不僅本身可介導多條信號轉導通路,還與其他途徑交互作用[24]。有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號途徑[25],PKC isoforms,c-Jun N-terminal kinase(JNK)和Akt[13]增強CaNNFAT信號轉導,這些信號通路協(xié)同調節(jié)細胞的功能[24]。除了rs1407877,其他的多態(tài)性均位于內含子區(qū)域,其功能意義未知。位于內含子非編碼區(qū)的SNPs可以調控mRNA的拼接,從而影響基因表達[12]和表型[16,17]。非編碼區(qū)的SNPs也可能影響轉錄因子的結合[10]。下一步的研究應該綜合性地對這些基因多態(tài)性進行功能分析以探清具體的關聯(lián)機制。

此外,我們研究有一定的不足,缺少血壓的測量數(shù)據(jù)以及18周訓練引起的心臟結構及功能指標變化較小,后者降低了對心肌表型的訓練反應的潛在基因型影響的程度。另外,如果有一個對照組能加強我們的研究結果,將來的研究要克服以上的不足。volume and cardiac outputduring submaximal exercise:the HERITAGE family study[J].Int J Sport Med,2000,(21):566-572.

4 結論

PPP3CC基 因 的rs1879793、rs1075534、rs7430、rs2461483、rs10108011和PPP3R2基因的rs1407877與心臟功能表型的訓練敏感性關聯(lián),PPP3CB基因的rs3763679與安靜的心率初始值關聯(lián)。CaN編碼基因多態(tài)性能夠部分解釋心臟功能表型的個體差異。

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Polymorphisms in the Calcineurin Genes Associated with the Training Responsiveness of Cardiac Phenotypes of Male Adult of H an Nationality in North Region of China

HE Zi-hong1,HU Yang2,LI Yan-chun2,BAO Da-peng2,LIU Gang2,XI Yi3,WEN Li4

This paper studied the association of 55 polymorphisms in the PPP3CA,PPP3CB, PPP3CC,PPP3R1 and PPP3R2 genes with both(i)the pre-training levels and(ii)responsiveness to endurance training(18 weeks),of echocardiography variables.The latter were measured both before and after the training program at each of the following time points:before(rest),during,and after cycle-ergometry exercise.All multiple comparisons were corrected for mass significance.For genotype:phenotype associations at pre-training,we only found a significant association between the rs3763679 polymorphism(PPP3CB)and resting heart rate.As for genotype associations with trainability of cardiac phenotypes,we found the following significant associations(i.e.significantgenotype＊training interaction effect):(i) rs1879793,rs1075534,rs7430,rs2461483,and rs10108011(PPP3CC)and cardiac output/ stroke volume after exercise;and(ii)rs1407877(PPP3R2)and ejection fraction at 50 watts. The findings suggest that polymorphisms in the calcineurin genes might be among the numerous potential genetic variant candidates that can help explain human variations in the pre-training levels or trainability of cardiac phenotype traits.

echocardiography;endurance exercise;association study

G804.7 文獻標識碼:A

1000-677X(2010)09-0066-07

2010-07-05;

2010-08-06

國家科技部課題(2003BA904B04);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費資助(06-15)。

何子紅(1977-),女,山東五蓮人,副研究員,博士,研究方向為運動能力的分子遺傳學及優(yōu)秀運動員的訓練監(jiān)控, Tel:(01)87182524,E-mail:zihong_he@hotmail.com。

1.國家體育總局體育科學研究所,北京100061;2.北京體育大學科研中心,北京100084;3.深圳大學體育系,廣東深圳518060;4.天津體育學院運動人體科學系,天津300381 1.China Institute of Sport Science,Beijing 100061,China;2.Beijing Sport University,Beijing 100083,China; 3.ShenzhenUniverseity,Shenzhen518060,China; 4.Tianjin University of Sport,Tianjin 300381,China.