補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方對(duì)胰腺癌模型小鼠Shh信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

胡波 萬細(xì)叢 邱幸凡 張六通

（1湖北省鄂州市中醫(yī)院 鄂州 436000；2湖北中醫(yī)學(xué)院 武漢 430000）

Sonic hedgehog（Shh）信號(hào)通路是在動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用的重要信號(hào)分子之一。最近研究發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路在多種腫瘤組織中呈激活狀態(tài)，因此該途徑可能在促使干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1，2]。胡偉國等通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：Shh信號(hào)分子對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖起維持作用，通過特異性阻斷該信號(hào)通路，可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。

筆者師從邱幸凡教授多年，根據(jù)邱師關(guān)于“臟虛絡(luò)痹毒結(jié)”的腫瘤發(fā)病機(jī)制，結(jié)合臨床，自擬補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方治療胰腺癌，取得了良好的臨床療效。為了進(jìn)一步探索該方產(chǎn)生療效的分子生物學(xué)機(jī)制，我們應(yīng)用補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方作用于胰腺癌模型小鼠，觀察其對(duì)Shh信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與造模

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性裸小鼠（BALB/C）24只，6～8 周齡，體重（20±2）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行飼養(yǎng)及管理。

1.2 細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞系SUIT-2，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人胰腺癌細(xì)胞系SUIT-2復(fù)蘇后，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)前觀察1周，若裸鼠生長正常（死亡率不超過10%），即分別于左后腿外側(cè)皮內(nèi)注射SUIT-2細(xì)胞1×106個(gè)，建立移植瘤模型。隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組12只。治療組予補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方灌胃，對(duì)照組予生理鹽水灌胃。

1.5 藥物及制備 補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方（人參5g、黃芪30g、枳殼 10g、川芎 15g、地龍 10g、柴胡 8g、蜈蚣3g、莪術(shù) 15g、龍葵 15g、炙甘草 6g等），用 5倍于藥材的冷水浸泡20min，武火煎至水沸，改用文火煎煮40min，濾出藥液加冷水適量，煎至水沸，改用文火煎煮30min，濾出藥渣，將兩次藥液混勻濃縮成每毫升含生藥2g的藥液，置于冰箱0～4℃保存。按人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積折算法算得小鼠等效劑量為每公斤體重60g生藥，即3mL/100g體重。

1.6 給藥劑量與方法 移植癌細(xì)胞后，待移植瘤肉眼可見時(shí)，對(duì)照組按3mL/100g體重給予生理鹽水灌胃，治療組按3mL/100g體重給予補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方灌胃，每日1次，連續(xù)14d。

1.7 儀器試劑 PCR儀：MG96G，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)：JY04S-3D，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；電泳槽：JY-SCZ2，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD，雙人平面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電泳儀：JY300+型多用途電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)：GL21M長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；制冰機(jī)：FM50，北京長流科學(xué)儀器公司；超低溫冰箱：DW-HL218，中科美菱；Gel-Pro4.5 System：圖像分析系統(tǒng)；離心機(jī)80-2，上海手術(shù)器械廠；DNA Marker、DNA Marker DL2000：批號(hào)20091123，天根生化科技（北京）有限公司；Rnasin：批號(hào) 20091212，寶生物工程（大連）有限公司；dNTP酶：批號(hào) 20091223，F(xiàn)ermentas life sciences；二乙基焦磷酰胺 （diethylpyrocarbonate,DEPC）：批號(hào) 20091209，Sigma；β-actin 引物：批號(hào)20091224，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司Shh引物：批號(hào)20071226，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Trizol：批號(hào) 20091129，Omega。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠盡快取出瘤體，并投入液氮凍存以作進(jìn)一步研究。

2.2 瘤組織ShhmRNA水平測(cè)定

2.2.1 瘤組織總RNA提取和質(zhì)量鑒定 用Trizol試劑提取瘤組織總RNA。取50～100 mg瘤組織加入1 mL Trizol，勻漿器中勻漿至液態(tài)，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，室溫靜置3 min，然后12 000γ、4℃離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，棄掉不溶的組織沉淀。上清液中加入200μL氯仿，反復(fù)顛倒混勻15s，室溫靜置3min，12 000γ、4℃離心15 min。小心吸取上清至新的離心管，加入500μL異丙醇，混勻，室溫靜置 10 min，12 000γ、4℃離心 10 min，棄掉上清，用75%乙醇1mL洗滌RNA沉淀，混懸混勻后7 500γ、4℃離心5 min，充分棄掉上清，室溫干燥RNA沉淀5～10 min，用50μL二乙基焦磷酰胺處理過的無菌水溶解RNA，55℃水浴10min助溶。取5μL用于瓊脂糖甲醛變性膠電泳鑒定完整性，另取5μL加45μLDEPC無菌水用紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量，其余RNA保存于-85℃?zhèn)溆谩Ａ鼋M織RNA的瓊脂糖甲醛變性膠電泳顯示28S、18S、5S三條帶，28S、18S條帶有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，5S條帶較弱。紫外分光光度計(jì)測(cè)得RNA光吸收比值（A260/A280）均在1.8～1.9之間，說明RNA純度可靠。

2.2.2 CRHmRNA基因擴(kuò)增方法 采用RT-PCR法對(duì)ShhmRNA水平進(jìn)行半定量分析，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR反應(yīng)：在20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。0.5μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶（10U/μL）、0.7μLRnasin（30U/μL）、2μL 10mM dNTP（10mM），42℃、45min，95℃變性 5min。在 50μLPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：95℃、50s，55℃、1min，72℃、1min，循環(huán) 30 次，72℃延伸10min。并在互聯(lián)網(wǎng)上搜索GENEBANK中小鼠Shh基因，確定CRH引物序列為：上游5′-CGGAGCGAGGAAGGGAAAG-3′ ， 下 游 5′-TTGGGGATAAACTGCTTGTAGGC-3′，擴(kuò)增長度262bp。內(nèi)參照基因β-actin引物序列為：上游引物 5’-AGAAGATGACCCAGATCATGTT-3’，下游引 物 5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，擴(kuò)增片段的長度為290bp。

2.2.3 結(jié)果分析 取20μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，與上樣緩沖液混勻，在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行恒壓電泳（100V、40min）。電泳結(jié)束后，將凝膠置于JY04S-3D凝膠圖像分析儀上進(jìn)行拍照分析。膠片進(jìn)行灰度掃描，以目的條帶的灰度值與β-actin條帶的灰度值的比值進(jìn)行半定量分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

兩組ShhmRNA表達(dá)見表1。經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.01，兩組半定量結(jié)果有極顯著性差異，治療組小鼠ShhmRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組，說明補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方能下調(diào)ShhmRNA表達(dá)。

表1 兩組ShhmRNA表達(dá)半定量結(jié)果 （±S）

表1 兩組ShhmRNA表達(dá)半定量結(jié)果 （±S）

動(dòng)物分組 動(dòng)物數(shù)目（只） Shh灰度值/β-actin灰度值治療組 12 0.32±0.17對(duì)照組 12 0.64±0.21

4 討論

Shh是Hedgehog信號(hào)蛋白家族成員，在多種器官組織的發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用[4]。Shh信號(hào)途徑由 Shh、2個(gè)跨膜受體 Patched（Ptc）和Smoothed（Smo）組成的受體復(fù)合物、蛋白激酶A以及下游轉(zhuǎn)錄因子 Gli家族（Glil、Gli2、Gli3）等組成在進(jìn)化上高度保守[5]。在正常胰腺的發(fā)育和胰腺癌的發(fā)生過程中，Shh信號(hào)途徑發(fā)揮著重要作用[6，7]Shh信號(hào)通路在多種器官的成體干細(xì)胞的維持和自我更新中也發(fā)揮作用,而其中許多分子已被作為癌基因或抑癌基因所認(rèn)識(shí)[1]。因此Shh信號(hào)途徑可能在促使干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中具有重大意義。

自擬補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方中人參味甘、微苦，微溫能大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾益肺，為君藥；黃芪味甘，性微溫能補(bǔ)氣生陽、益衛(wèi)固表，能增強(qiáng)人參的補(bǔ)氣功效，為臣藥；柴胡及枳殼味辛，性溫，有行氣之功效；川芎莪術(shù)味辛，性溫，有活血化瘀之功，故為佐藥；地龍及蜈蚣辛溫，能搜邪剔絡(luò)，無血者走氣，有血者走血，靈活迅速，與柴胡、枳殼、川芎、莪術(shù)配伍能引藥入氣絡(luò)及血絡(luò)，從而達(dá)到宣通絡(luò)脈的功效，故為使藥；龍葵性寒，味苦，微甘，具有小毒，有清熱解毒之功，亦為佐藥；炙甘草味甘，性微溫，有調(diào)和諸藥之功，故佐使藥：全方合用，共奏補(bǔ)氣通絡(luò)、解毒消瘤之功。本研究結(jié)果顯示，該方作用于胰腺癌模型小鼠，能有效抑制ShhmRNA基因的表達(dá)，從而起到阻斷Shh信號(hào)通路的作用，這也可能是該方治療胰腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制之一。

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