原生質體融合構建水稻病害生防多功能工程菌株

陳海榮，劉前剛，高書鋒，魏小武，程 安，黃 軍

（湖南省微生物研究所，湖南長沙410009）

隨著科學技術的發(fā)展，生物農藥以其高效、低毒、低殘留、不易產生抗藥性等優(yōu)勢，漸漸取代了傳統(tǒng)化學農藥的地位。原生質體融合技術，是指將一個細胞的遺傳物質包括細胞核DNA和核外基因進入另一個細胞，有機的結合形成一個新的整體——融合子。如果融合子能穩(wěn)定的存活下來，并具備雙親的特有性質，那么人們便能根據(jù)所需的特性，構建自己所需的工程菌株。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性枝狀細菌。它最早是由日本人石渡于1901年從家蠶病尸蟲體中分離出來，并在1915年由德國人Berliner命名的。其主要殺蟲活性成分是內部一種或多種δ-內毒素[1]。現(xiàn)已證實蘇云金桿菌可對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等9個目的500多種昆蟲有不同程度的殺蟲活性，對水稻常見害蟲如二化螟、三化螟及縱卷葉螟均有殺治效果[2-4]。枯草芽孢桿菌SD是一類具有抗病性的細菌，能有效防治水稻稻曲病和紋枯病，為湖南省微生物研究所植保室篩選所得。筆者擬利用原生質體融合技術選育一株對水稻稻曲病和紋枯病有抑制效果，且能起到殺蟲作用的工程菌株用于水稻的生物防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 供試菌株為蘇云金芽孢桿菌Bt，枯草芽孢桿菌SD。

1.1.2 培養(yǎng)基 搖瓶培養(yǎng)基:蛋白胨2%，牛肉膏0.7%，葡萄糖0.3%，MgSO40.03%，KH2PO40.03%，pH 7.2～7.5，蒸餾水配置，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽壓力滅菌30 min。

固體培養(yǎng)基（平皿，斜面用）:配方同上搖瓶培養(yǎng)基，另加1.6%的瓊脂粉，pH 7.2。

高滲固體培養(yǎng)基（原生質體再生，融合子再生用）:上述固體培養(yǎng)基加入0.5 mol/L的蔗糖，pH 7.2（底層）。

高滲固體培養(yǎng)基（上層）:同高滲固體培養(yǎng)基，瓊脂含量為0.8%。

1.1.3 主要試劑與溶液 高滲緩沖液:順丁烯二酸0.02 mol/L，MgCl20.02 mol/L，蔗糖 0.5 mol/L，pH 7.4左右，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽壓力滅菌30 min。

酶:溶菌酶，購自上海某生物公司，一定濃度的高滲緩沖液配制，先配成2 mg/mL的母液，使用時按需要的濃度用高滲液稀釋，細菌過濾器過濾。

1.2 方法

（1）菌株篩選：從沙土管中取出保存的Bt菌株與SD菌株，分別轉接入加有一定濃度的慶大霉素（Bt）和利福平（SD）的斜面培養(yǎng)基中，篩選出兩種具有不同抗藥性的菌株，培養(yǎng)待用。

（2）菌株活化：從斜面上挑取少量Bt和SD菌種，接種至搖瓶培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min條件下培養(yǎng)14 h左右，進行活化。

（3）菌株培養(yǎng)：分別將活化14 h的兩菌株發(fā)酵液1 mL移至 100 mL搖瓶培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)一定時間。

（4）洗滌：取兩種年輕菌液各4 mL到5 mL離心管中，離心3～5 min，除去上清，加入2 mL高滲緩沖液，振蕩均勻，再離心，重復3次，洗去細胞表面的附著物，便于酶解。

（5）酶解去壁:加入一定量的酶，在一定溫度的水浴鍋中酶解破壁，得到原生質體。

（6）原生質體融合:將得到的Bt與SD原生質體等體積混合，8 000 r/min離心3 min，加入40%PEG 2 mL 和 Ca（NO3）2飽和液 0.2 mL，混勻，放入41℃水浴中融合30 min。

（7）原生質體再生培養(yǎng):融化低層高滲固體培養(yǎng)基，冷卻至45℃時，加入慶大霉素和利福平，濃度均為1μg/mL，搖勻，倒平皿，作為底層培養(yǎng)基，每平皿20～25 mL。融化上層高滲培養(yǎng)基，冷卻至45℃時按1∶5的比例將融合的原生質體懸濁液與其混勻，倒入底層培養(yǎng)基中，每皿5 mL左右，凝固后，放入恒溫箱30℃培養(yǎng)。

（8）待平皿中有菌落生成時，初步認定為融合子。

（9）傳代培養(yǎng):用相同濃度的慶大霉素和利福平制作雙抗試管斜面若干，將平皿中的菌落挑取少量接入其中，傳接10代，確保其菌體穩(wěn)定。

（10）菌株鑒定：取出10代菌體，進行與雙親菌株性質的比較和鑒定。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定及培養(yǎng)時間的選擇

分別將活化14 h的兩菌株發(fā)酵液1 mL移至100 mL空白搖瓶培養(yǎng)基中，搖勻，取15支無菌大試管，每支加入 5 mL，30℃，220 r/min 培養(yǎng)，每 1 h 取樣一次，測定560 nm下的吸光度[5]。作圖1，算出對數(shù)生長期，以便保證酶對細胞壁的作用效果最好。

在菌齡的選擇上，多采用對數(shù)生長期或生長后期的菌，這是因為菌體的不同生理狀態(tài)直接影響到細胞壁的結構，對數(shù)生長期細菌的細胞壁中肽聚糖含量最低，細胞壁對酶的作用最敏感。由圖1可知，培養(yǎng)5 h左右后，Bt與SD都進入對數(shù)生長期。為確定被酶解破壁的細胞為對數(shù)生長期細胞，我們把活化的菌體在搖瓶中培養(yǎng)的時間確定為5 h。

2.2 酶解濃度的選擇

在 Bt和 SD菌液中分別加入 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL濃度的溶菌酶，酶解2 h，平板計數(shù)法觀察原生質體的得率[6]，確定最佳酶解濃度。以酶濃度為橫坐標，原生質體得率為縱坐標作圖2。

圖2 不同溶菌酶濃度對Bt和SD原生質體得率的影響

酶濃度過低，會影響原生質體得率，過高，則對后期試驗有影響。由上圖可知，兩菌株的酶解破壁都很徹底，得率在80%以上。其中SD對酶更為敏感，得率也更高?？梢猿醪酱_定，Bt的最佳酶解濃度為0.8 mg/mL，SD的最佳酶解濃度為0.6 mg/mL。

2.3 酶解時間的選擇

選擇好酶解濃度后，我們用最佳濃度對Bt和SD兩菌液進行酶解，每10 min取樣一次，平板計數(shù)法計算兩菌株原生質體得率，用酶解時間為橫坐標，原生質體得率為縱坐標作圖3。

有研究表明[7-8]，不同微生物在原生質體制備過程中最適酶解時間差異很大。酶解時間不夠，得到的原生質體數(shù)量過少，融合效果不好；酶解時間過長，原生質體得率提高，但破壁過于徹底對原生質體再生會產生不利影響。由圖3可知，Bt在酶解70 min后，原生質體得率基本穩(wěn)定，SD在酶解50 min后，原生質體得率基本穩(wěn)定?？梢曰敬_定，Bt的最佳酶解時間為70 min，SD的最佳酶解時間為40 min。

2.4 融合子的初步檢測

將兩原生質體等量加入到高滲緩沖液中融合后，在特定的雙抗培養(yǎng)基中有菌斑出現(xiàn)。挑選菌株在雙抗培養(yǎng)基中傳接10代，確保其穩(wěn)定性。隨機挑選4個10代菌體接入含水稻稻曲病和紋枯病病原菌的培養(yǎng)皿中，作CK空白對照，觀察結果如圖4所示。由圖4可知，在接種菌株后的培養(yǎng)皿中，菌斑周圍有明顯的透明環(huán)，說明該菌落對水稻稻曲病和紋枯病病原菌有抑制作用，具備親本SD的抗菌效果。

選新鮮水稻葉片在一定濃度的融合子溶液中浸漬3 s，取出自然晾干，放入10個培養(yǎng)皿中。其中5個培養(yǎng)皿的葉片上接入10頭水稻二化螟2齡幼蟲，另外5個培養(yǎng)皿的葉片上接入10頭水稻縱卷葉螟2齡幼蟲，密封。48 h后觀察幼蟲死亡情況，發(fā)現(xiàn)近半害蟲已經(jīng)死亡。這說明該融合子有殺蟲功效，具備Bt的性質。

3 小結

利用細胞融合技術構建新型多功能工程菌，為生物農藥的研制和開發(fā)提供了新的方法和思路。本試驗選取了兩種不同功能的微生物菌種Bt與SD，通過融合實驗條件的摸索，初步確定了菌種培養(yǎng)時間、酶解最佳濃度、酶解最佳時間，對融合子進行了部分的驗證，基本符合預想的功效。準備結合形態(tài)學、生理生化特性及基因檢測技術，對融合子進行進一步檢查和證實。我們希望能篩選得到一株既能殺蟲有能防治病害的融合子，為下一步開發(fā)微生物生防制劑打下堅實基礎。

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