水稻OsTIR1啟動(dòng)子的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

龔 蓉 ，鐘菲菲 ，2，黃志剛

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410018）

生長(zhǎng)素（auxin）是最早被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)植物激素，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的許多方面[1-3]。水稻生長(zhǎng)素作用機(jī)制的研究對(duì)于揭示超級(jí)雜交稻超高產(chǎn)機(jī)理并指導(dǎo)育種工作具有重要意義。在生長(zhǎng)素受體的發(fā)掘過(guò)程中，科學(xué)家先后發(fā)現(xiàn)了兩種能與生長(zhǎng)素發(fā)生特異性結(jié)合作用的蛋白質(zhì)，生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP1[4]與生長(zhǎng)素受體蛋白TIR1[5]，但隨后的證據(jù)表明ABP1并不是真正的生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白[6-7]。因此，作為發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)生長(zhǎng)素受體，TIR1在生長(zhǎng)素作用機(jī)制的研究中有著關(guān)鍵的意義。隨著研究的不斷深入，TIR1在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制上的作用逐漸清晰[8-9]，使得研究者迫切地想了解植物體內(nèi)TIR1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。真核基因表達(dá)調(diào)控一直是近代分子生物學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，是眾多基因表達(dá)調(diào)控方式中最直接、最有效的。啟動(dòng)子是指基因中一段可與RNA聚合酶及其它一些影響轉(zhuǎn)錄的反式因子結(jié)合實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確有效起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列[10]。作為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控的順式元件，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，因此啟動(dòng)子的分離及功能分析不僅是植物基因表達(dá)調(diào)控研究的重要內(nèi)容，也是植物基因工程研究的一個(gè)重要方面。

本研究擬基于生物信息學(xué)方法從超級(jí)稻株1 S中克隆OsTIR1的啟動(dòng)子，并對(duì)水稻TIR1啟動(dòng)子基因功能元件進(jìn)行分析，將該啟動(dòng)子與GUS基因融合，于轉(zhuǎn)基因植物中分析啟動(dòng)表達(dá)的時(shí)空特異性及表達(dá)強(qiáng)度，為進(jìn)一步深入研究水稻TIR1的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超級(jí)雜交水稻（Oryza sativa L.）母本株1S由湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院提供。轉(zhuǎn)化受體菌E.coli DH 5α，帶CaMV 35 s啟動(dòng)子的GUS基因的質(zhì)粒PBI 121均由本室保存。T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶 Xba I和 Hind III、LA Taq DNA 聚合酶、GC buffer和pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自安比奧公司。PCR引物合成，測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 水稻種子在25℃條件下發(fā)芽，幼苗長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)，采用CTAB法小量提取水稻幼苗葉片基因組DNA。

1.2.2 TIR1啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上已報(bào)道的TIR1基因cDNA的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)了克隆TIR1基因啟動(dòng)子序列的上下游引物，為了便于定向克隆和載體構(gòu)建，在上游引物和下游引物的5′端分別引入Xba I和Hind III酶切位點(diǎn)：

上游引物5'-GCAAGCTTACAAATCGAGAACCAAGA-3'

下游引物 5'-ATTCTAGACATGCTGCAACGGATCG-3'

劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)。以水稻基因組DNA為模板，在上述特異性引物的作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：DNA模板2μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，dd H2O 5.4 μL，2×GC Buffer 10 μL，dNTP 0.4 μL，La Taq DNA聚合酶0.2μL。PCR參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s，54℃退火 40 s，72℃延伸 2.5 min，27個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)完成后，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢查擴(kuò)增片段的特異性和大小，然后將含有目的片段的膠塊切下，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。

1.2.3 TIR1啟動(dòng)子的克隆與重組子的鑒定 將回收后的目的片度與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有卡那霉素（Kan）LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子。提取白色單菌落的質(zhì)粒DNA，用PCR擴(kuò)增和Hind III/Xba I雙酶切兩種方法鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pMD19-pTIR1。將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序確證。

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用Xba I和Hind III雙酶切后，同時(shí)用相同的限制性?xún)?nèi)切酶將植物表達(dá)載體PBI 121上CaMV 35 S啟動(dòng)子切除，回收相應(yīng)的酶切片段，在T4連接酶的作用下將TIR1啟動(dòng)子酶切片段與PBI 121酶切產(chǎn)物16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為PBI121-pTIR1。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsTIR1啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

以超級(jí)雜交稻基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，得到一條長(zhǎng)度約為1 500 bp的特異條帶（圖1），該片段與預(yù)期片段大小基本相符。

2.2 OsTIR1啟動(dòng)子序列的克隆與序列分析

將PCR產(chǎn)物回收純化后，將純化的目的片段克隆入pMD19-T載體后，經(jīng)PCR擴(kuò)增和Xba I和Hind III雙酶切后得到的片段與PCR結(jié)果相吻合（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示該片段包含1 530個(gè)核苷酸，與NCBI中的TIR1基因的啟動(dòng)子序列比對(duì)后無(wú)突變。

圖2 質(zhì)粒pMD19-pTIR1雙酶切鑒定

圖1 TIR1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增

采用植物順式元件分析軟件PLACE和Plant－Care軟件分析所克隆到的OsTIR1基因啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)其中含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子的保守元件，說(shuō)明它具有潛在的啟動(dòng)子活性。其中預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件13個(gè)TATA-box和10個(gè)CAAT-box，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子序列還包含多個(gè)特異性調(diào)控元件，包括11個(gè)與光應(yīng)答相關(guān)的啟動(dòng)子序列元件，如AE-box，CATT-motif，G-box，GAG-motif，GT1-motif等。此外，還發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)厭氧誘導(dǎo)所需的順式調(diào)控元件ARE和3個(gè)晝夜節(jié)律調(diào)控元件Circadian等，序列分析如圖3所示。

圖3 TIR1啟動(dòng)子序列及其結(jié)構(gòu)

2.3 植物表達(dá)載體PBI121-pTIR1的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pMD19-pTIR1用Xba I和Hind III雙酶切后，回收目的片段，與經(jīng)同樣酶切的PBI 121植物表達(dá)載體連接，從而使TIR1啟動(dòng)子替換表達(dá)載體上的CaMV 35 S啟動(dòng)子。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α，經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定均可見(jiàn)約1 500 bp的目的片段（圖4），表明成功地構(gòu)建了PBI121-pTIR1植物表達(dá)載體。

圖4 質(zhì)粒的雙酶切鑒定

3 討論

生長(zhǎng)素是植物生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用的植物激素，生長(zhǎng)素受體作為研究生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)鏈的最重要環(huán)節(jié)，研究它的高表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重大的意義。到目前為止，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并沒(méi)有明朗，比如生長(zhǎng)素是怎樣促進(jìn)T1R1-Aux/IAA相互作用的，生長(zhǎng)素與Aux/IAA之間的關(guān)系問(wèn)題等。分離TIR1啟動(dòng)子基因，有助于從基因水平上對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了水稻TIR1基因的啟動(dòng)子，經(jīng) PLACE（http://www.dna.afrc.go.jp/PLACE/signalscan.htm）分析后發(fā)現(xiàn)：在該片段中存在多個(gè)順式作用原件如ARE及多種光響應(yīng)元件如GATA-motif、G-box和CATTmotif等這些都是在光誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子中的保守元件，能夠調(diào)節(jié)基因受光誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄活性。Reyes[11]研究表明，在植物中，GATA-box在光誘導(dǎo)和硝酸鹽誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起作用；另外還存在多個(gè)增強(qiáng)子系和廣東省有一定恢復(fù)力的常規(guī)品種，結(jié)實(shí)率低于50%的組合2個(gè)，低于60%的2個(gè)，感光的1個(gè)，其余均在70%以上，恢復(fù)比例97.7%，表現(xiàn)突出的有盛泰A/0510，結(jié)實(shí)率86.3%，單株重35.8克，比同條件對(duì)照金優(yōu)207增產(chǎn)12.3%，比同父異母組合岳4A/0510增產(chǎn)8.7%；在品種比較試驗(yàn)中，盛泰A/岳恢9113平均產(chǎn)562.8 kg/667m2，比岳優(yōu)9113增產(chǎn)5.86%。

綜合3 a配合力測(cè)定情況，盛泰A恢復(fù)譜比較廣，在恢復(fù)材料范圍內(nèi)，恢復(fù)比例達(dá)到96.5%，多數(shù)類(lèi)型恢復(fù)結(jié)實(shí)達(dá)80%以上。其配制的盛泰A/9712、盛泰 A/E318、盛泰 A/9264、盛泰 A/9722、盛泰 A/R018、盛泰A/C402分別進(jìn)入多個(gè)省級(jí)區(qū)試的續(xù)試和初試。

2.7 繁殖制種性狀

2007年一季小量繁種，8月3日始穗，花期處于高溫條件下，53.3 m2繁殖收種17 kg，折合產(chǎn)212.5 kg/667m2。2008年小量制種，在岳優(yōu)9113制種基地，盛泰A制100 m2，收種38.5 kg，折合產(chǎn)256.7 kg/667m2，隨機(jī)取樣調(diào)查，異交結(jié)實(shí)61.3%，比同條件下的岳4A高8.2個(gè)百分點(diǎn)，表現(xiàn)出良好的異交結(jié)實(shí)特性。

3 小結(jié)

經(jīng)3 a試驗(yàn)研究，盛泰A農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，花粉敗育徹底，敗育率100%，典敗率99.93%；自交結(jié)實(shí)率0.027‰；開(kāi)花習(xí)性好，平均花時(shí)為10:38，午前花率76.3%，花時(shí)較岳4A早13 min，開(kāi)穎角度30°18′；柱頭外露率83.8%，異交結(jié)實(shí)性好，良好情況下，一般結(jié)實(shí)可達(dá)60%以上；播始?xì)v期67～86 d，可進(jìn)行春制和秋制。特別是盛泰A不育系米質(zhì)優(yōu)，米質(zhì)遺傳力強(qiáng)，一般配合力好，配組子一代依據(jù)父本熟期，可作中遲熟連晚和一季晚稻栽培。盛泰A不育系多個(gè)組合在省級(jí)區(qū)試中表現(xiàn)突出，在高檔優(yōu)質(zhì)雜交稻研究上有廣闊的應(yīng)用前景，建議加速該不育系的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

[1]蔣遜平，謝曉陽(yáng)，歐光輝.新質(zhì)源優(yōu)質(zhì)不育系岳4A的選育與應(yīng)用[J].雜交水稻，1999，14（2）：3-5.

[2]蔣建為，蔣遜平，謝曉陽(yáng)，等.優(yōu)質(zhì)雜交水稻新組合岳優(yōu)9113的選育[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，（2）：9-11.

[3]蔣遜平，謝曉陽(yáng)，張 勝，等.秈型優(yōu)質(zhì)新不育系絲苗A特征特性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，（2）：14-16.

[4]蔣建為，歐陽(yáng)光輝，夏照明，等.新組合新香優(yōu)9113的選育與栽培技術(shù)研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（5）：18-19.

[5]程式華，李 健.現(xiàn)代中國(guó)水稻[M].北京：金盾出版社，2007.