鹽膚木總黃酮的提取研究

陳存武，張 莉，何曉梅，程衛(wèi)兵，馬甲林

（皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽省植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安 237012）

鹽膚木（Rhus chinensisMill.）又稱五倍子樹、五倍柴等，屬于漆樹科（Anacardiaceae）鹽膚木屬（Rhus）的落葉灌木或喬木[1]，在我國廣泛分布，主要用于生產(chǎn)中藥原料五倍子，是我國的主要經(jīng)濟(jì)樹種之一。目前，人們對(duì)鹽膚木的研究主要在于如何改進(jìn)其栽培技術(shù)，提高五倍子的產(chǎn)量，而對(duì)鹽膚木植株所含有的黃酮類物質(zhì)的研究報(bào)道不多見。筆者研究了鹽膚木植株總黃酮類物質(zhì)的含量及其最佳提取方法，旨在為更好的開發(fā)利用鹽膚木資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為鹽膚木（Rhus chinensisMill.），采自皖西學(xué)院植物園。

1.2 儀器與試劑

儀器：TU-1901紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器設(shè)備有限公司），HH—4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠），F(xiàn)A-1004電子天平（上海精科天平廠），KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試劑：蘆丁、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、無水乙醇等，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 材料處理 在鹽膚木果實(shí)成熟時(shí)采回植株，清洗干凈，按照樹皮、葉片、葉柄、果實(shí)、果皮、種子等進(jìn)行分類，于103℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，分裝備用。采用索式抽提法[2]，以無水乙醚為脫脂劑，于45℃水浴加熱脫脂一周以上，直至回流液無色、用玻璃棒蘸取回流液滴在濾紙上風(fēng)干后無印跡為止，以充分除去樣品中脂類物質(zhì)和脂溶性色素。脫脂后的樣品除去乙醚備用。

1.3.2 提取條件研究[3]（1）單因素實(shí)驗(yàn)：選取浸提溫度、浸提時(shí)間、液料比、乙醇濃度等作為影響鹽膚木葉片總黃酮提取率的研究因素。在研究其中的某個(gè)因素時(shí)，其他因素均以水平3作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)。每個(gè)被研究的因素設(shè)6個(gè)水平，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，計(jì)算平均值。每個(gè)樣浸提3次，合并浸提液，以總黃酮的提取率為指標(biāo)，分別找出各因素的最適提取條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

（2）正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)，找出最佳提取條件。

1.3.3 黃酮含量測定[4-5]利用黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)生成的絡(luò)合物，在510 nm處有穩(wěn)定吸收峰的特性，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法即亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定溶液吸光度，得到其中的總黃酮含量。

（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱取103℃烘箱中烘至恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%乙醇定容至100 mL為標(biāo)準(zhǔn)液。再精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 分別置于 6 支具塞試管中，各補(bǔ)水至5 mL。加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，再加4%NaOH溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻后放置15 min，在510 nm處測吸光度。計(jì)算吸光度-濃度曲線及回歸方程。

（2）樣品中總黃酮含量的測定：分別取各樣品的浸提液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法，測定其510 nm處的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算其總黃酮含量。

1.3.4 鹽膚木植物各部分的總黃酮提取率測定分別精確稱取1.0 g除脂后的鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實(shí)、果皮、種子等，按照正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取條件回流浸提10次，合并浸提液，測定其總黃酮含量，計(jì)算其總黃酮提取率。各做3個(gè)平行樣，計(jì)算其平均值。

鹽膚木總黃酮提取率（%）=提取液所含黃酮質(zhì)量（g）/鹽膚木原料質(zhì)量（g）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.3.3的方法制作的黃酮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，其回歸方程y=1.256 6x-0.004 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，可以用作黃酮含量測定使用。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浸提溫度對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設(shè)定的浸提溫度，其他因素均以水平3作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)鹽膚木葉片總黃酮的提取率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果見圖2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可以看出，隨著溫度升高，葉片總黃酮的提取率由 40℃時(shí)的 1.8%升高到 70℃時(shí)的4.04%，但當(dāng)溫度超過70℃時(shí)提取率有所下降?？紤]到溫度對(duì)黃酮成分穩(wěn)定性的影響，浸提溫度以70℃比較合適。

圖2 浸提溫度對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設(shè)定的提取時(shí)間，其他因素均以水平3作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)鹽膚木葉片總黃酮的提取率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長，黃酮類物質(zhì)的提取率也逐漸增大，但在提取時(shí)間達(dá)到150 min后，提取率增加的幅度逐漸減小。綜合提取效率等因素，合適的提取時(shí)間應(yīng)選150 min為宜。

2.2.3 液料比對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響按照表1中設(shè)定的液料比，其他因素均以水平3作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)鹽膚木葉片總黃酮的提取率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，提取劑的液料比為80∶1時(shí)，鹽膚木葉片總黃酮的提取率最高，液料比增大或減小都不利于鹽膚木葉片總黃酮的提取。

圖4 液料比對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響

2.2.4 乙醇濃度對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設(shè)定的乙醇濃度，其他因素均以水平3作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)鹽膚木葉片總黃酮的提取率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著乙醇濃度的增高，總黃酮的提取率增大，當(dāng)乙醇濃度超過90%時(shí)提取率降低，當(dāng)乙醇濃度為95%時(shí)，提取率為2.92%?？梢娫谝掖紳舛葹?0%時(shí)提取效果最佳。

圖5 乙醇濃度對(duì)鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取了合適的提取時(shí)間、浸提溫度、乙醇濃度、液料比，采用四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)，以總黃酮的提取率為指標(biāo)，對(duì)鹽膚木葉總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2中的極差R值可以看出，ABCD四因素對(duì)鹽膚木葉總黃酮提取率的影響依次是：B>A>C>D，即提取時(shí)間影響最大，其次是浸提溫度與料液比，乙醇濃度影響最小。從正交實(shí)驗(yàn)的總黃酮提取率可以看出，第九組即A3B3C2D1，為總黃酮的最佳提取工藝，即在80℃條件下，用70%的乙醇為提取劑，以80∶1的液料比提取180 min，其提取率可以達(dá)到5.22%，與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異。

2.4 鹽膚木植株各部分總黃酮提取率

采用正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝，分別提取鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實(shí)、果皮、種子的總黃酮，共提取10次，合并浸提液。每個(gè)樣做三個(gè)平行。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定其總黃酮含量，計(jì)算提取率。結(jié)果如表3所示，鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實(shí)、果皮、種子的總黃酮提取率分別為5.84%、2.32%、1.02%、2.01%、1.80%和0.54%。。

表3 鹽膚木植株各部分的總黃酮提取率 （%）

3 小結(jié)

植物黃酮類物質(zhì)的提取方法有超聲波法、微波法等多種[6-7]，本文采用乙醇為提取劑的有機(jī)溶劑提取法，具有設(shè)備簡單、操作方便快捷的特點(diǎn)，也容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，最適合的浸提溫度是70℃，浸提時(shí)間是150 min，液料比在80∶1，乙醇濃度為70%，但是正交實(shí)驗(yàn)的最佳提取條件是80℃，80∶1的液料比，70%的乙醇濃度，提取180 min。兩者在浸提溫度與浸提時(shí)間上雖然有些差異，但是一次正交實(shí)驗(yàn)的總黃酮提取率就達(dá)到5.22%，達(dá)到葉片的總黃酮提取得率5.84%的89.4%，這也反映出正交實(shí)驗(yàn)在提取工藝優(yōu)化過程中的優(yōu)選性能。用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的提取工藝提取鹽膚木總黃酮，葉片總黃酮的提取率達(dá)到5.84%，高于銀杏葉[11]總黃酮2.87%的提取率，果實(shí)的總黃酮提取率也達(dá)到2.01%。這說明該優(yōu)化工藝合適鹽膚木總黃酮的提取，鹽膚木總黃酮含量較高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，有待于進(jìn)一步的開發(fā)研究。

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