類球紅細(xì)菌突變株及其應(yīng)用

黨磊 靳明慧 田菁 王瑋 王小雪 龐欣

（中國空間技術(shù)研究院空間生物實驗室，北京100190）

輔酶Q10(CoQ10)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的脂溶性醌類化合物，俗稱泛醌[1,2]。輔酶Q10在動植物、微生物等細(xì)胞內(nèi)與線粒體內(nèi)膜結(jié)合,是呼吸鏈中重要的遞氫體[3]，能加速產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)，是細(xì)胞呼吸和代謝的激活劑，也是細(xì)胞自身產(chǎn)生重要的天然抗氧化劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑。

輔酶Q10的制備方法有動植物細(xì)胞提取法，化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。與動植物細(xì)胞提取和化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法具有生物活性好，易被人體吸收和原料不受限制，成本低，易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模等優(yōu)點而被公認(rèn)為最具有優(yōu)勢和潛力的一種技術(shù)工藝[4-6]。

類球紅細(xì)菌1.1737可用于生產(chǎn)輔酶Q10。但在從該菌的發(fā)酵液提取輔酶Q10時，需要用層析方法吸附色素等水溶性物質(zhì)。由于該菌的發(fā)酵液為深紅色，要耗費較大量的層析填料用于脫色，層析所用的填料用量多少與生產(chǎn)輔酶Q10的成本相關(guān)。如果能夠得到色澤較淺的類球紅細(xì)菌發(fā)酵液，則可減少層析填料的用量，直接降低輔酶Q10的生產(chǎn)成本。

此外，類球紅細(xì)菌1.1737生產(chǎn)輔酶Q10的產(chǎn)量不高，通常搖瓶發(fā)酵水平僅達(dá)到20-25mg/L。近年來，通過空間環(huán)境誘變的方法篩選高產(chǎn)量的突變株成為大家研究的熱點。本文采用空間環(huán)境誘變的方法對類球紅細(xì)菌1.1737進(jìn)行菌種選育。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 菌株

類球紅細(xì)菌1.1737購自中國微生物菌種保藏中心。類球紅細(xì)菌突變株為我室篩選獲得，現(xiàn)已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 2359，保藏時間為2008年1月25日。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(%)：葡萄糖0.2，牛肉膏0.3，魚蛋白胨1.0，酵母膏0.5，氯化鈉0.5，瓊脂粉1.5，pH7.0。

種子培養(yǎng)基(%)：葡萄糖2.0，魚蛋白胨1.0，酵母粉1.0，氯化鈉0.5，碳酸鈣 0.5，pH7.2。500毫升三角瓶分裝，8層紗布封口滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：葡萄糖2.7，白砂糖2.0，玉米漿4.0，硫酸銨0.8，磷酸二氫鉀0.05，磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.025。500毫升三角瓶分裝，8層紗布封口滅菌

1.2 方法

1.2.1 空間誘變育種

（1）航天育種衛(wèi)星搭載樣品準(zhǔn)備

取生長良好的類球紅細(xì)菌1.1737菌體培養(yǎng)物在無菌條件下轉(zhuǎn)移到搭載專用管中，擰緊管蓋，接口處用封口膜封口后裝入搭載用大管，送交搭載前于4℃保存。此搭載管放入“實踐八號”航天育種衛(wèi)星的實驗裝置中，在太空中隨飛船飛行15天后回收。

（2）搭載的空間環(huán)境

在本次育種衛(wèi)星飛行過程中，空間環(huán)境的相關(guān)數(shù)據(jù)為：衛(wèi)星姿態(tài)控制為三軸穩(wěn)定姿態(tài)，其中衛(wèi)星的I象限指向地面，衛(wèi)星回收艙小頭為飛行方向。育種衛(wèi)星軌道為橢圓形傾斜軌道，衛(wèi)星運行在近地點高度為180km遠(yuǎn)地點高度為460km的軌道上，軌道傾角為63°，近地點位置在北緯35°附近，衛(wèi)星飛行15天，共飛行236圈，236圈通過回收區(qū)中心。測試結(jié)果表明，本次飛行試驗期間空間輻射劑量最大為5.893mGy，最小2.484mGy。平均日劑量在0.401～0.169 mGy之間。衛(wèi)星在軌期間種子測溫點的最大溫度為20.72℃，最低溫度為7.21℃。

1.2.2 地面突變株的篩選

在無菌條件下取培養(yǎng)面積為0.5平方厘米的搭載回收樣品，用5毫升無菌水洗脫菌體到無菌離心管中，用移液器吸打均勻菌體洗脫液，取0.5毫升該菌液到4.5毫升無菌水中，吸打均勻，以此類推，做倍比稀釋。取10-4和10-5稀釋液涂布到固體平板培養(yǎng)基，每塊平板上涂150微升稀釋菌液，每個稀釋梯度涂多塊平板。待菌液被培養(yǎng)基吸收后于培養(yǎng)箱中30℃倒置培養(yǎng)2-7天。待平板上長出菌落后，通過搖瓶發(fā)酵實驗初步篩選輔酶Q10含量比對照菌株高的菌株。

1.2.3 菌株穩(wěn)定性實驗

對初篩選到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時使用固體培養(yǎng)基。經(jīng)過50次以上的傳代，保證菌株的穩(wěn)定性。初篩菌株經(jīng)過多次傳代后，進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩菌株進(jìn)行固體和種子液培養(yǎng)后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 輔酶Q10的測定

向各發(fā)酵液中分別加入6 mol/L的鹽酸，調(diào)pH值到2-4，之后加入6 mol/L氫氧化鈉溶液，使pH值回復(fù)到6-8，將發(fā)酵液離心，取沉淀60-80℃烘干，研磨后按質(zhì)量體積比（1:100）加入無水乙醇，超聲處理。處理液再次離心取上清上樣。輔酶Q10的測定：按照中華人民共和國藥典中輔酶Q10的檢測方法進(jìn)行。

1.2.5 用柱層析提取輔酶Q10的方法[7]

向發(fā)酵液中分別加入6 mol/L的鹽酸，調(diào)pH值到2-4，之后加入6 mol/L氫氧化鈉溶液，使pH值回復(fù)到6-8，將菌液離心取菌體，按照固液比例（1：10）加入石油醚，打散菌體，使之與提取溶劑混合均勻。45℃搖床，180rpm條件下提取2小時。提取液離心取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得浸膏用石油醚和乙酸乙酯的混合物溶解上樣。

利用不銹鋼常壓柱作為層析柱，以60-100目的硅膠作固定相，柱子徑高比為1:15，樣品與硅膠的質(zhì)量之比為1:10，上樣前用洗脫劑飽和柱子。洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合物。

樣品過柱的同時，進(jìn)行薄層分析。當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果一致時，即可開始正樣收集，當(dāng)收集液的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果不一致時，停止收集。

此實驗的目的在于比較不同硅膠用量（40%，45%，50%）對出發(fā)菌株與突變株發(fā)酵液中輔酶Q10產(chǎn)率的影響。

1.2.6 輔酶Q10合成相關(guān)基因測序

檢測高產(chǎn)輔酶Q10菌株中輔酶Q10合成相關(guān)基因是否發(fā)生變化，選取輔酶Q10合成過程中的關(guān)鍵酶基因ddsA (十異戊二烯焦磷酸合成酶)基因和ubiC基因（丙酮酸合成酶）基因測序。

樣品總DNA提取方法按蓋寧生物科技公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的步驟操作。兩個基因的擴(kuò)增引物均由生工生物工程（上海）公司合成ddsA引物為：ddsA-F：5’-ATGGGATTGGACGAGGTTTCGCAA-3’，ddsA-R：5’-TCAGGCGATGCGTTCGACCA-3’。ubiC引物為：ubiC-F：5’-TTGGCTCAGGGACAGCACA-3’， ubiC-R：5’-TTAATGGGCGTCGGTTGCGA-3’。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

2.結(jié)果與分析

2.1 突變株的篩選

取搭載樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，在平板培養(yǎng)物中共獲得328個單菌落，通過搖瓶發(fā)酵試驗和多次傳代培養(yǎng)后，進(jìn)一步的HPLC檢測篩選到一株顏色變化較大，輔酶Q10產(chǎn)量明顯提高的突變株（見圖1，2，表1 所示），定義為space QG 1.1737-168，后將此菌種保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2359。

由表中多次重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)可得，突變株的輔酶Q10的含量較出發(fā)菌株平均提高了30.4%。

2.2 柱層析提取輔酶Q10

樣品處理后分別上樣于裝有40g，45g，50g硅膠的層析柱中，通過石油醚和乙酸乙酯混合物的洗脫得到分純的輔酶Q10，其產(chǎn)率如圖3所示。

由圖中數(shù)據(jù)可看出，隨著硅膠用量的減少，space QG 1.1737-168菌株的輔酶Q10產(chǎn)率逐漸高于對照菌株，即在輔酶Q10產(chǎn)率相同的情況下，利用space QG 1.1737-168菌株發(fā)酵，由于其發(fā)酵液顏色較淺，可節(jié)省層析填料，降低層析成本。

2.3 基因測序結(jié)果

輔酶Q10由一個醌環(huán)和一個類異戊二烯側(cè)鏈組成。輔酶Q10的醌環(huán)是由對羥基苯甲酸(PHB)合成的，異戊二烯側(cè)鏈?zhǔn)怯杉琢u戊酸經(jīng)異戊烯焦磷酸(IPP)合成而來。在輔酶Q10生物合成途徑中，催化類異戊二烯側(cè)鏈合成的是聚異戊烯焦磷酸合成酶(PPP合成酶)，在類球紅細(xì)菌中它是由ddsA (十異戊二烯焦磷酸合成酶)基因編碼。ubiC基因是分支酸裂解酶，在細(xì)菌中催化分枝酸合成對羥基苯甲酸，羥基苯甲酸是合成醌環(huán)的前體物質(zhì)。

ddsA基因和ubiC基因測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對，結(jié)果顯示高產(chǎn)菌株的這兩個基因沒有發(fā)生變化，說明該高產(chǎn)菌株的輔酶Q10含量提高，并不是由這兩個基因變化引起的，推測可能與合成輔酶Q10的其他基因有關(guān)，或者是相關(guān)的調(diào)節(jié)代謝基因的變化。

3.討論

隨著人類對空間資源的開發(fā)利用和世界航天工業(yè)的發(fā)展，有關(guān)空間環(huán)境對生物體的效應(yīng)研究已備受重視[9]，而空間誘變育種是其研究的主要應(yīng)用之一?？臻g誘變育種突破了傳統(tǒng)育種模式，已作為提供新的種質(zhì)資源的途徑得以應(yīng)用[10]。

本文通過類球紅細(xì)菌的搭載實驗為利用空間環(huán)境選育微生物菌種提供了一定的實驗和理論依據(jù)。實驗結(jié)果表明，經(jīng)搭載篩選到的突變株，該菌菌落顏色變淺，且具有良好的的遺傳穩(wěn)定性，輔酶Q10的產(chǎn)量比出發(fā)菌株平均提高了30.4%。在后期柱層析的提取純化過程中發(fā)現(xiàn)，硅膠用量40g時即可將輔酶Q10與色素分開，而對照菌株在相同硅膠用量條件下分離不完全。輔酶Q10產(chǎn)率相同的情況下，利用space QG 1.1737-168菌株發(fā)酵，可節(jié)省層析填料，降低層析成本。

在類球紅細(xì)菌的代謝過程中，類胡蘿卜素與CoQ10合成有共同的前提物質(zhì)聚異戊二烯，因此，對于顏色較淺的菌株，合成的類胡蘿卜素就較少，自然合成CoQ10的量就提高。因此在篩選過程中，利用菌落顏色篩選顏色較淺的菌株，可能會得到發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10含量高的菌株。另外，已有研究[11]利用色深突變表性作為CoQ10高產(chǎn)菌株重要的篩選標(biāo)志，但本實驗認(rèn)為色淺菌株更有利于發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10的后期提取純化處理，可以減少色素處理步驟。因此，選用顏色淺且CoQ10產(chǎn)量高的突變菌是適合生產(chǎn)的最佳菌株。

經(jīng)過測序分析，合成輔酶Q10的關(guān)鍵酶基因ddsA基因和ubiC基因沒有發(fā)生變化，那么是相關(guān)的其他基因發(fā)生了變化還是相關(guān)調(diào)控基因發(fā)生變化，有關(guān)色素合成的相關(guān)基因是否發(fā)生變化，還需要進(jìn)一步的研究。

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