植物防御素的生物學(xué)活性及其應(yīng)用前景

楊樹維，馮娟*，任正隆

（電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都，四川，610054）

通過自身產(chǎn)生抗菌肽來防御微生物的侵害，是生物先天免疫的重要組成部分，這種古老的防御機(jī)制廣泛存在于微生物，節(jié)肢動(dòng)物，植物和動(dòng)物中。抗菌肽中一個(gè)極為重要的大家族統(tǒng)稱為防御素，這些多肽首先發(fā)現(xiàn)于兔子的巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞中［1,2,3］，隨后在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了防御素［4,5］，之后的研究表明防御素廣泛存在于自然界中。事實(shí)上，防御素這個(gè)大家族中的分子在結(jié)構(gòu)和功能上具有驚人的保守性，它們已經(jīng)從兩大生物界中被鑒定出來，而且至少被劃分為五類。前三類防御素發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物和鳥類中［6,7,8］，第四類和第五類防御素發(fā)現(xiàn)于昆蟲和植物中［9］，同時(shí)這些分子的代表也見于軟體動(dòng)物和真菌中。

植物防御素因其在結(jié)構(gòu)和功能上與之前在昆蟲和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的防御素抗菌肽相似而得名。目前的研究表明，植物防御素是植物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它們普遍存在于各種植物中，并且各類植物防御素的代表也從多種多樣的植物中不斷被發(fā)現(xiàn)。

1 植物防御素的結(jié)構(gòu)

植物防御素的編碼區(qū)域主要可以劃分為兩個(gè)部分，一個(gè)是信號(hào)肽區(qū)域，它引導(dǎo)多肽分泌到胞外空間，另一個(gè)是成熟肽區(qū)域，此外有些種類開花植物的防御素還存在一個(gè)碳末端結(jié)構(gòu)域。

植物防御素通常含有45～54個(gè)氨基酸殘基，其中包括8個(gè)半胱氨酸殘基，分子量約為5.0 kD。通過對(duì)各種材料植物防御素的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們除了8個(gè)保守的半胱氨基酸殘基外，其余位置的氨基酸殘基均非常不保守，具有較低的同源性。不過植物防御素的高級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，Rs-AFP1的核磁共振結(jié)果表明，該多肽以一個(gè)致密的球形結(jié)構(gòu)存在，其中包括3個(gè)反平行β-折疊片層和1個(gè)α-螺旋，8個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成了4對(duì)二硫鍵從而穩(wěn)定了這一結(jié)構(gòu)［10］。Kobayashi等人發(fā)現(xiàn)位于α-螺旋中的第21位Cys和25位Cys與位于第三β-折疊片層中的第45位Cys和47位Cys形成了兩對(duì)二硫鍵，對(duì)于維持該結(jié)構(gòu)發(fā)揮了關(guān)鍵作用［11］，Cornet等人將其命名為Cys穩(wěn)定的α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)模序，簡(jiǎn)稱CSαβ［12］。

2 植物防御素的體外活性

2.1 酶抑制劑活性

2.1.1 α-淀粉酶抑制劑

Bloch和Richardson等人首先證實(shí)了植物防御素具有抑制昆蟲α-淀粉酶的活性［13］，名為SIα1,SIα2和SIα3的3種多肽，均對(duì)昆蟲消化酶α-淀粉酶表現(xiàn)出特異性的抑制，并且對(duì)真菌和人唾液淀粉酶具有弱的抑制活性，而其對(duì)于來自豬胰腺，大麥和細(xì)菌的α-淀粉酶無抑制活性。由于一些植物防御素具有抑制昆蟲內(nèi)臟α-淀粉酶的活性，因此暗示了植物防御素在植物抗蟲害方面發(fā)揮著重要作用，即很可能植物防御素是通過降低昆蟲對(duì)淀粉的消化能力的方式來發(fā)揮其殺蟲作用的。

Lin等人研究發(fā)現(xiàn)β-轉(zhuǎn)角3（Loop3）對(duì)于植物防御素α-淀粉酶抑制劑活性的發(fā)揮起著重要的作用，在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)同樣是來源于綠豆種子中的植物防御素VrD2，雖然具有與VrD1極其相似的結(jié)構(gòu)，但是并沒有對(duì)黃粉甲蟲α-淀粉酶的抑制活性，于是他們對(duì)VrD1和VrD2進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和表面電荷性質(zhì)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)VrD1在第二β-折疊（β2）和第三β-折疊（β3）之間有一個(gè)較長的β-轉(zhuǎn)角（Loop3），相比之下VrD2則較短，同時(shí)先前其與黃粉甲蟲α-淀粉酶（TMA）分子對(duì)接結(jié)果顯示，Loop3能夠插入到TMA的活性位點(diǎn)，從而影響酶活性中心與底物的相互作用。Loop3中Arg等帶正電荷的氨基酸殘基被認(rèn)為與酶活性位點(diǎn)氫鍵的形成有關(guān)。隨后它們通過基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程手段對(duì)VrD2進(jìn)行了改造，用VrD1的Loop3取代了VrD2中相應(yīng)的部分，并且發(fā)現(xiàn)由此得到的重組VrD2具有與VrD1相似的TMA抑制活性。這項(xiàng)研究充分說明電荷性質(zhì)和轉(zhuǎn)角的長度是影響植物防御素α-淀粉酶抑制劑活性的關(guān)鍵因素。事實(shí)上，不同來源α-淀粉酶催化位點(diǎn)空間立體結(jié)構(gòu)的差異也是影響植物防御素α-淀粉酶抑制劑活性的重要因素。

2.1.2 蛋白酶抑制劑

研究人員從一種殺蟲植物豬腸豆（Cassia fistula ）中分離出來兩種植物防御素，其中名為5459的多肽表現(xiàn)出對(duì)胰蛋白酶的抑制活性，相反另外一種多肽5144則無該活性。5459與5144的區(qū)別僅僅在于為數(shù)不多的幾個(gè)氨基酸殘基的差異，研究證實(shí)第25位氨基酸殘基由Thr到Lys的替換與酶抑制劑活性密切相關(guān)［14］。

已經(jīng)有人提出，植物防御素是通過抑制昆蟲消化功能的方式來實(shí)現(xiàn)其殺蟲效果的［15］。Vulgarin和WCB- AFP兩種植物防御素均表現(xiàn)出對(duì)胰蛋白酶消化的耐受性，盡管它們對(duì)于胰蛋白酶的抑制活性沒有得到檢驗(yàn)，但是這種抗蛋白酶消化的特性從一方面暗示了它們的蛋白酶抑制劑活性?？傊?，有關(guān)植物防御素發(fā)揮蛋白酶抑制劑活性的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。

2.2 抗微生物活性

早在20世紀(jì)90年代，Terras等人首次發(fā)現(xiàn)了植物防御素的抗菌活性［16］。植物防御素的抗微生物活性主要表現(xiàn)在抗真菌上，而對(duì)一些革蘭氏陽性菌也存在抑制作用，不過其抑制作用較真菌偏弱。

Br-AFP2（一種抗真菌肽）在52μgmL-1的濃度下對(duì)巨大芽孢桿菌（B.megaterium）具有抑制作用［17］，從菠菜中分離得到的防御素在低于20μM（IC50）的濃度下對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌（C.Michiganensis）和青枯病菌（P.solanacearum）具有抑制作用［18］。WCBAFP分別在125,101,86μM(IC50)的濃度下對(duì)B.Megaterium, 枯草芽胞桿菌（B.Subtilis）, 草分支桿菌（M.Phlei）具有抑制作用。與真菌相反，植物防御素對(duì)細(xì)菌生長抑制的作用機(jī)制仍然不清楚，將來對(duì)于植物防御素受體的研究是解釋其抗細(xì)菌作用機(jī)制的關(guān)鍵所在。

植物防御素能夠抑制真菌類微生物的生長，這些真菌包括：黑曲霉（Aspergillus niger）、粉色面包霉菌（Neurospora crassa）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；還包括許多真菌性病原菌，如：灰霉菌（Botrytis cinerea）、球孢枝孢菌（C.Sphaerospermum）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）、大刀鐮孢菌（Fusariumculmorum）等。值得注意的是，植物防御素對(duì)于真菌的抑菌活性和抑菌濃度與真菌的種類和植物防御素本身的特性有關(guān)。例如，Ah-AMP1對(duì)于植物病原體大刀鐮孢菌（Fusari um culmorum）的半抑制濃度（IC50）為12μgmL-1，而 Rs-AFP2對(duì)該菌的IC50僅僅為1.512μgmL-1，TvD1能夠在100μgmL-1的濃度下對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）產(chǎn)生抑制作用，而BSD1對(duì)該菌的IC50可以達(dá)到500μgmL-1以上［19］。更為有趣的是，經(jīng)植物防御素處理后的真菌，其顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)并非所有的防御素對(duì)真菌的生長均產(chǎn)生相同的效果，而是出現(xiàn)兩種截然不同的效果，由此可以將植物防御素分成兩類。第一類以Rs-AFP1,Rs-AFP2和Hs-AFP1為代表，定名為形態(tài)發(fā)生防御素，因?yàn)樗鼈儾坏种普婢纳L，而且還誘導(dǎo)其菌絲體形態(tài)發(fā)生變化。特別是在這類防御素存在的情況下，真菌的菌絲體出現(xiàn)分支，膨脹和縮短等變化；第二類包括Dm-AMP1, Dm-AMP2, Ah-AMP1和Ct-AMP1, 歸為非形態(tài)發(fā)生防御素［20,21］。

總之，抗菌肽的高級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出兩親性的排列，具有一個(gè)帶正電荷的親水表面。已經(jīng)有人提出，抗菌肽和靶微生物相互作用的首要條件是堿性的多肽與微生物表面相反電荷靜電相互作用的引發(fā)，在靜電相互作用產(chǎn)生之后，抗菌肽的疏水性區(qū)域通過疏水相互作用插入到膜結(jié)構(gòu)中，因而在金屬陽離子存在的情況下，金屬離子競(jìng)爭(zhēng)性地與膜受體結(jié)合，從而引起起始靜電相互作用的減弱，最終導(dǎo)致多肽抑菌活性的降低［22,23］。與此同時(shí)，Oard 和Karki［24］提出一種與競(jìng)爭(zhēng)模型不同的機(jī)制，他們認(rèn)為金屬陽離子的存在會(huì)對(duì)抗菌肽β-purothionin的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使其結(jié)構(gòu)朝不利于發(fā)揮生物活性的方向變化。

2.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞活性

植物防御素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞活性的研究，最早集中在對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及肌肉和皮膚組織成纖維母細(xì)胞生長力的檢測(cè)上，此外還檢測(cè)了這些多肽對(duì)人紅細(xì)胞的溶解作用。只有當(dāng)這些細(xì)胞與濃度低于500 μgmL-1的Rs-AFP1和Rs-AFP2孵育時(shí)才出現(xiàn)生長力降低的變化，而其他植物防御素并無明顯作用效果。早已經(jīng)有報(bào)道，WCBAFP對(duì)鼠脾臟細(xì)胞的有絲分裂具有促進(jìn)作用，然而研究人員也發(fā)現(xiàn)該植物防御素并不能誘導(dǎo)鼠腹膜中巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生［25］。此外，RBAFP和PBAFP也具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的活性［26］。

3 生物技術(shù)應(yīng)用前景

植物防御素所表現(xiàn)出來的生物學(xué)活性，使其受到生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，這些特性包括抗微生物活性，殺蟲活性，甚至還有抗寄生植物活性。正是因?yàn)檫@些特性使得植物防御素成為蛋白質(zhì)工程和植物抗病蟲害基因工程優(yōu)良的候選材料。此外，有些植物防御素不僅僅對(duì)一種真菌起作用，而是對(duì)多種植物真菌病原體都有抑制活性，這是其生物技術(shù)應(yīng)用的又一大優(yōu)勢(shì), 例如從蘿卜（Raphanus sativus）中提取的植物防御素Rs-AFP2就對(duì)多種真菌具有抑制活性，其濃度變化范圍從1到3μgmL-1［16］，因而植物防御素這些特性對(duì)于R基因介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。除此之外，植物防御素還能夠與其他的抗菌化合物共同作用，有助于植株抗性的增強(qiáng)［27,28］，最終植物防御素可能帶來植株除抗微生物活性之外對(duì)于非生物脅迫的適應(yīng)。

近十年來，過去將殺菌肽作為一種新型治療藥物的想法被重新點(diǎn)燃，殺菌肽所表現(xiàn)出的一些活性引起研究人員的注意。這些活性包括⑴廣泛的抗菌譜，包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物，甚至腫瘤細(xì)胞；⑵所需劑量低和快速的殺菌效果；⑶與其他殺菌肽和臨床治療藥物的協(xié)同作用；⑷具有使肉毒素失活的活性，因而有助于防止敗血性休克；⑸它們的作用靶點(diǎn)主要是細(xì)胞質(zhì)膜，因此不大可能產(chǎn)生耐藥性。⑹它們通常對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性低。⑺一些殺菌肽具有調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物先天免疫的能力，從而開辟了一種新的治療手段［29,30］。不過，目前在將植物防御素作為治療劑方面仍然存在許多理論和技術(shù)上的問題，不過欣慰的是科學(xué)家們正在努力地解決這些難題。

已經(jīng)證實(shí)，通過轉(zhuǎn)基因的手段將植物防御素基因重組到植物的基因組中，可以使植物體組織產(chǎn)生對(duì)于病原體的抗性。目前已有多種防御素基因?qū)胫仓曛幸栽黾又仓昕剐?并檢測(cè)到了已表達(dá)的植物防御素蛋白及其抗菌活性，如煙草、馬鈴薯、水稻、擬南芥、油菜和哈密瓜等。Terras等人將一種蘿卜種子防御素Rs2AFP2的基因轉(zhuǎn)入煙草中，其表達(dá)量可達(dá)葉片總蛋白的0.2% ,明顯增強(qiáng)了植株對(duì)于小葉病源真菌煙草赤星病菌（Alternaria longipes）的抗性［31］，之后又有研究人員將其應(yīng)用于番茄上，并且獲得了類似的結(jié)果［32］。一種豌豆防御素在甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）中組成型表達(dá)能夠增強(qiáng)其對(duì)于黑脛病的抗性［33］。此外，Gao等人［34］將從苜蓿（Medicagosativa）種子中分離到的防御素alfAFP的基因在馬鈴薯中表達(dá)，抗菌結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因馬鈴薯增強(qiáng)了對(duì)大麗花輪枝孢菌( Verticillium dahliae) 的抗性,并且在田間種植情況下仍能保持很好的抗菌活性。近年來國內(nèi)在植物防御素轉(zhuǎn)基因研究中也取得了一些成功，王賀一等人通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功地將白芥防御素基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，獲得了抗卡那霉素的再生轉(zhuǎn)基因植株，不過轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步的研究［35］，隨后又有研究人員通過類似的方法獲得了卡那霉素抗性的河套蜜瓜植株。

植物防御素PsD1可與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)，開辟了一種人類腫瘤治療的新思路[36,37,38]。事實(shí)上，植物防御素對(duì)特定種類人腫瘤細(xì)胞的抑制活性已有報(bào)道，如Vulgarinin能夠抑制白血病的L1210和M1細(xì)胞系，抑制率分別為35%和80%，而其對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的抑制率為80%左右。人宮頸癌細(xì)胞系（Hela）能夠被一種來自芙蓉菊的植物防御素所抑制，抑制率大約為80%，而limyin對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞系和神經(jīng)母細(xì)胞SHSY5Y的IC50分別為43和28μM［39］。不過，植物防御素對(duì)癌細(xì)胞抑制活性的作用機(jī)理仍然沒有得到解釋。

總之，植物防御素以其廣泛的抗菌譜和高效性的特點(diǎn)，有望發(fā)展成為一種新型抗菌藥和抗腫瘤藥物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康帶來深遠(yuǎn)影響。并且隨著人們對(duì)植物防御素作用機(jī)制的不斷了解，闡明其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系后，我們能夠?qū)⑵渥鳛榈鞍踪|(zhì)工程的骨架，通過基因水平的改造，獲得人們所期望的生物學(xué)活性。

[1] Petterson-Dela.eld J, Martinez RJ, Lehrer RI.Infect Immun 1980;30(1):180-92.

[2] Petterson-Dela.eld J, Szklarek D, Martinez RJ, Lehrer RI.Infect Immun 1981;31(2):723-31.

[3] Selsted ME, Brown DM, DeLange RJ, Lehrer RI.J Biol Chem 1983;258(23):14485-9.14445-52.

[4] Lambert J, Keppi E, Dimarcq J-L, Wicker C, Reichhart J-M,Dunbart B, et al.Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:262-6.

[5] Matsuyama K, Nafori S.Puri.J Biol Chem 1988;263:17112-6.

[6] Ganz T.CR Biol 2004;327:539-49.

[7] Tang Y-Q, Yuan J, O¨ sapay G, O¨ sapay K, Tran D, Miller CJ, et al.Science 1999;286:498-502.

[8] van Djik A, Veldhuizen EJA, Haagsman HP.Vet Immunol Immunopathol 2008;124:1-18.

[9] Broekaert WF, Terras FRG, Cammue BPA, Osborn RW.Plant Physiol 1995;108:1353-8.

[10] Fant F, Vranken W, Broekaert W, Borremans F.J Mol Biol 1998;279:257-70.

[11] Kobayashi Y, Takashima H, Tamaoki H, Kyogoku Y, Lambert P, Kuroda H, et al.Biopolymers 1991;31:1213-20.

[12] Cornet B, Bonmatin J-M, Hetru C, Hoffmann JA, Ptak M,Vovelle F.Re.Structure 1995;3:435-48.

[13] Bloch CJ, Richardson M.FEBS 1991;279(1):101-4.

[14] Wijaya R, Neumann GM, Condron R, Hughes AB, Poly GM.Plant Sci 2000;159:243-55.

[15] Molosov VV, Valeuva TA.Appl Biochem Microbiol 2008;44(3):233-40.

[16] Terras FRG, Schoofs HME, De Bolle MFC, VanLeuven F, Rees SB, Vanderleyden J, et al.J Biol Chem1992;267(22):15301-9.

[17] Terras FRG, Torrekens S, Van Leuven F, Osborn RW,Vanderleyden J, Cammue BPA, et al.FEBS 1993;316(3):233-40.

[18] Segura A, Moreno M, Molina A, Garcia-Olmedo F.FEBS Lett 1998;435:159-62.

[19] Park HC, Kang YH, Chun HJ, Koo JC, Cheong YH, Kim CY,et al.Plant Mol Biol 2002;50:59-69.

[20] Broekaert WF, Terras FRG, Cammue BPA, Osborn RW.Plant Physiol 1995;108:1353-8.

[21] Osborn RW, De Samblanx GW, Thevissen K, Goderis I,Torrekens S, Van Leuven F, et al.FEBS Lett 1995; 368:257-62.

[22] Brogden KA.Nat Rev Microbiol 2005;3:238-50.

[23] De Samblanx GW, Goderis IJ, Thevissen K, Raemaekers R,Fant F, Borremans F, et al.J Biol Chem 1997;272(2):1171-9.

[24] Oard S, Karki B.Biophys Chem 2006;121:30-43.

[25] Wong JH, Zhang XQ, Wang HX, Ng TB.Peptides 2006;27:2075-81.

[26] Ye XY, Ng TB.J Peptide Res 2002;60:81-7.

[27] Chen S-C, Liu A-R, Zou Z-R.Russ J Plant Physiol 2006;53(5):671-7.

[28] Oh B-J, KoMK, Kostenyuk I, Shin B,Kim KS.Plant Mol Biol 1999;41:313-9.

[29] Giuliani A, Pirri G, Nicoletto SF.CEJB 2007;2(1):1-33.

[30] Marr AK, GooderhamWJ, Hancock REW.Curr Opin Pharmacol 2006;6:468-72.

[31] Terras, F.R., Eggermont, K., Kovaleva, V., Raikhel, N.V.,Osborn, R.W., Kester, A., Rees, S.B., Torrekens, S., Van Leuven, F.and Vanderleyden J.Plant Cell 1995;7:573-588.

[32] Parashina, E.V., Serdobinskii, L.A., Kalle, E.G., Lavorova, N.V., Avetisov, V.A., Lunin, V.G.and Naroditskii, B.S.Plant Physiol 2000;47:417-423.

[33] Wang, Y., Nowak, G., Culley, D., Hadwiger, L.A.and Fristensky, B.Mol.Plant-Microbe Interact 1999;12: 410-418.

[34] Gao A G, Hakimi S M , Mittanck C A , et al.Nat Biotechnol 2000;18 (12):1307.

[35] 王賀一,羅勤,吳俊,等.四川大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版2007;44:1335.

[36] Kong M, Barnes EA, Ollendorff V, Donoghue DJ.EMBO J 2000;19:1378-88.

[37] Lobo DS, Pereira IB, Fragel-Madeira L, Medeiros LN, Cabral LM, Faria J, et al.Biochemistry 2007;46:987-96.

[38] Yasuda M, Takesue F, Inutsuka S, Honda MNT, Korenaga D.J Cancer Res Clin Oncol 2002;128:412-6.

[39] Wang S, Rao P, Ye X.Appl Microbiol Biotechnol 2008;doi:10.1007/s00253-008-1729-2.