經(jīng)皮冷凍豬肺的影像學(xué)和病理學(xué)研究

牛立志 王靜 邱大衛(wèi) 周亮 吳炳輝 方剛

唐俊 穆峰 李海波 梅保君 鄧春梅 鄧春娟 郝卓芳 徐克成

肺癌已成為最常見死因的惡性腫瘤之一，大部分確診時已屬中晚期，失去了手術(shù)切除機(jī)會[1-4]。對不能手術(shù)切除的肺癌，冷凍是一種安全可選擇的消融治療手段。研究[5-7]顯示冷凍治療肝癌、腎癌、胰腺癌等實(shí)體器官腫瘤時，一般認(rèn)為應(yīng)將冷凍范圍超過腫瘤邊緣，即所謂“1 cm安全邊緣”，以達(dá)到全部消融靶組織的目的。但與冷凍肝臟、胰腺等實(shí)體器官不同，肺為含氣組織，氣體阻礙熱量的傳導(dǎo)，冷凍范圍在理論上很難超過腫瘤邊緣，從而難以獲得完全消融。為了解決肺冷凍的技術(shù)問題，本研究觀察了豬肺經(jīng)皮冷凍的影像學(xué)、大體解剖學(xué)和組織學(xué)表現(xiàn)，試圖在不同冷凍條件下探討經(jīng)皮冷凍肺的治療技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6只月齡均為12個月的西藏小型豬由南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。平均體重為23 kg，均有健康合格證書。常規(guī)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前2周內(nèi)接受常規(guī)檢查，無飲食和行為異常。分別將6只豬標(biāo)記為豬1、2、3、4、5和6。本研究設(shè)計(jì)獲得復(fù)大醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 冷凍治療系統(tǒng) 冷凍設(shè)備采用氬氦冷凍系統(tǒng)（EndorcareTM, CA, USA），該系統(tǒng)是根據(jù)焦耳定律設(shè)計(jì)，其原理是高壓氣體經(jīng)過狹窄的噴嘴進(jìn)入探針尖端，壓力突然下降，不同的氣體在局部產(chǎn)生不同的溫度變化。氬氣引起溫度降低（可達(dá)-150oC），氦氣可使溫度升高（可達(dá)60oC）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 對豬進(jìn)行捆綁固定，將豬右側(cè)臥位，對術(shù)區(qū)進(jìn)行消毒、備皮等。用速眠新3 mL誘導(dǎo)麻醉，然后給予1.5%-2%濃度異氟醚維持全身麻醉，氧流量保持在1.5 L/min。在CT下，選擇豬左肺上葉1點(diǎn)和下葉2點(diǎn)作為靶點(diǎn)，將1.7 mm冷凍探針分別插入左肺上葉和下葉各靶點(diǎn)。以100%的氬氣激活探針，使針尖溫度達(dá)（-140±5）oC，持續(xù)10 min，改輸氦氣復(fù)溫至（25±5）oC，持續(xù)5 min，為第1個循環(huán)。重復(fù)上述冷凍/復(fù)溫循環(huán)，共行2個循環(huán)。左肺冷凍完成后，將豬左側(cè)臥位，對豬的右肺冷凍與左肺冷凍時相似，同樣選擇3個靶點(diǎn)進(jìn)行冷凍，不同點(diǎn)是做了3個循環(huán)的冷凍-復(fù)溫循環(huán)：即先行2個冷凍5 min、復(fù)溫5 min的循環(huán)，第3循環(huán)為冷凍10 min、復(fù)溫5 min。術(shù)中對豬進(jìn)行心肺監(jiān)護(hù)。冷凍完畢后拔針，用明膠海綿止血。術(shù)后肌注速尿20 mg、地塞米松5 mg和青霉素160 IU。6只豬的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方法均相同。

1.4 術(shù)后觀察 豬1在術(shù)后表現(xiàn)為體溫降低，心跳減慢，于3 h40 min后死亡。其余豬麻醉蘇醒后正常圈養(yǎng)，第1天即給予正常飲食，觀察其生命體征和器官功能。喂養(yǎng)期間未給予靜脈輸液、抗生素或其它藥物。

1.5 標(biāo)本的選取 豬1死亡后立即解剖，豬2和3在術(shù)后3天、豬4、5和6在術(shù)后7天分別靜脈給予戊巴比妥注射液100 mg/kg處死（此處置方法獲得復(fù)大醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)）。解剖取大體肺組織標(biāo)本。將凡是黑色區(qū)域的冷凍部位假定為靶組織，稱為“假定壞死區(qū)”。測量假定壞死區(qū)最大徑數(shù)值，然后取中心區(qū)、邊緣區(qū)及邊緣外1 cm處的組織（圖1），福爾馬林溶液固定、蘇木精-伊紅溶液染色后，在光鏡下觀察組織學(xué)變化。使用20倍的放大率， 每個部位觀察6個樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)值均使用Mean±SD描述，用配對樣本t檢驗(yàn)對計(jì)量資料進(jìn)行分析， 以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺冷凍的CT下表現(xiàn) CT下，冷凍區(qū)（冰球）表現(xiàn)為相對于肺的高密度實(shí)變影，冷凍探針表現(xiàn)為金屬高密度影。最初形成的實(shí)變影相對模糊，與外周界限不清晰。隨著冷凍時間的延長，實(shí)變影逐漸清晰，顯示冰球逐漸增大。圖2顯示豬3冷凍過程中CT顯示的冰球演變，其大小隨冷凍時間延長，冰球最大徑增加由最初的2.4 cm→3.2 cm→2.9 cm→3.2 cm→3.5 cm→3.3 cm，呈現(xiàn)隨著冷凍時間延長冰球逐漸增大的趨勢。一般在復(fù)溫后冰球范圍較大，而再次冷凍后冰球變小，提示復(fù)溫后滲出，引起冰球增大。

左肺行冷凍2個循環(huán)，冷凍總時間為20 min；右肺行冷凍3個循環(huán)，總冷凍時間也為20 min。右肺3個循環(huán)形成的冰球大于左肺2個循環(huán)形成的冰球（表1）。圖3顯示豬2不同冷凍-復(fù)溫循環(huán)的左肺和右肺CT影像學(xué)變化。

2.2 肺冷凍的大體表現(xiàn) 豬1為冷凍后急性死亡，冷凍部位有出血，豬2、3和豬4、5、6分別在冷凍術(shù)后第3天和7天死亡，胸腔內(nèi)有少量滲液和出血。6只豬肺的假定壞死區(qū)均呈黑色，與周圍形成明顯界限（圖4）。假定壞死區(qū)最大徑豬1超過其它豬；6只豬右肺3個冷凍-復(fù)溫循環(huán)的假定壞死區(qū)范圍均超過左肺2個循環(huán)（表1）。

測定6只豬肺CT下冰球、假定壞死區(qū)最大徑，結(jié)果如表1。從表1可見，CT影像下右肺的冰球大于左肺，右肺3個循環(huán)冷凍假定壞死區(qū)范圍大于左肺2個循環(huán)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6只豬雙肺冰球大小為（2.5±0.4）cm，假定壞死區(qū)大小為（3.4±0.7）cm，無論豬為急性死亡或術(shù)后3天、7天處死，雙肺假定壞死區(qū)均較冰球大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 1 肺冷凍區(qū)標(biāo)本選取示意圖Fig 1 Specimens selected draft of the freezing area of the lung

圖 2 冷凍過程中（3個循環(huán)）冰球的CT表現(xiàn)Fig 2 Sequential changes of the pulmonary parenchyma on computed tomographic scanning after freezing and thawing(3 cycles). A: 5 min after the beginning of first freezing; B: 5 min after the beginning of first thrawing; C: 5 min after the beginning of second freezing; D: 5 min after the beginning of second thrawing; E: 10 min after the beginning of third freezing; F: 5 min after the beginning of third thawing.

2.3 肺冷凍的組織學(xué)改變 6只豬肺的冷凍中心區(qū)在組織學(xué)上均呈現(xiàn)完全性壞死；在中心區(qū)周圍的假定壞死區(qū)內(nèi)，豬1有活存細(xì)胞存在，而其它豬肺呈現(xiàn)全部出血性壞死；在假定壞死區(qū)邊緣外1 cm處， 6只豬肺均無明顯壞死（圖5）。此結(jié)果顯示豬1的組織學(xué)壞死區(qū)小于假定壞死區(qū)，而冷凍3天后，其它豬肺假定壞死區(qū)和組織學(xué)壞死區(qū)大小一致。各豬左、右肺病變無明顯差別。此外，急性死亡的豬1標(biāo)本出血、水腫病變較其余兩組嚴(yán)重，術(shù)后7天處死的豬4、5和6標(biāo)本肉芽組織增生較其余兩組明顯。

3 討論

冷凍療法已愈來愈多用于實(shí)質(zhì)器官如肝、腎和前列腺腫瘤的治療。冷凍區(qū)內(nèi)溫度與距離冷凍探針的遠(yuǎn)近有關(guān)。中心部溫度可能降至-160oC—-196oC，但在可見到的冰球外緣溫度常為0oC。業(yè)已證明，冷凍溫度為0oC—-30oC時，細(xì)胞無明顯損傷；冷凍溫度為-40oC—-50oC 時，細(xì)胞死亡率明顯增加。一般認(rèn)為-40oC是引起靶細(xì)胞死亡的臨界溫度[5,8]。在此溫度以下的區(qū)域?yàn)橛行Ю鋬鰠^(qū)。為了達(dá)到這一目的，臨床上沿用外科手術(shù)切除腫瘤的“1 cm安全邊緣”概念[9]，即擴(kuò)大冷凍范圍，將有效冷凍范圍擴(kuò)展至腫瘤外至少1 cm[6]。

圖 3 豬2不同冷凍-復(fù)溫循環(huán)對CT上冰球大小的影響Fig 3 Pig 2's ice-ball change under different freeze-thaw cycles. Above is left lung after 2 freeze-thaw cycles cryo, diameter was 1:2.1 cm (A), 2:2.1 cm (B), 3:2.4 cm (C), respectively;Below is right lung after 3 freeze-thaw cycles cryo, diameter was 4:2.6 cm (D), 5:2.7 cm (E), 6:2.6 cm (F), respectively.

表 1 6只豬右肺與左肺的冰球和假定壞死區(qū)大?。╟m）Tab 1 Compare hypothetical necrotic area with the ice-ball in both lungs (cm)

圖 4 冷凍術(shù)后不同時間內(nèi)雙肺冷凍區(qū)的大體表現(xiàn)Fig 4 The morphological description of both lungs'sample at different times after cryoablation

圖 5 豬肺冷凍區(qū)光鏡下的組織學(xué)改變 (HE, ×20)Fig 5 Pathology of cryolesion of each pig under microscope (HE, ×20). A: lung tissues hemorrhage, necrosis; B: lung tissues hemorrhage, necrosis; C: lung tissues hemorrhage, necrosis; D: lung tissues vasodilatation, congest, lung tissues edema hemorrhage; E: alveolar septum congest edema, lung tissues hemorrhagic necrosis; F: necrosis around granulation tissue,alveolar epithelium and bronchiolar epithelium hyperplasia; G: alveolar structure is still maintained, part alveolar septum capillaries congests, few hemorrhage; H: alveolar structure is normal, part alveolar septum capillaries congests; I: alveolar structure is normal, surrounding alveolar capillaries congests，RBC and hemosiderin macrophages in part of alveolus.

如同肝、腎的腫瘤冷凍一樣，在理論上對肺癌的冷凍也應(yīng)覆蓋腫瘤周圍10 mm寬的正常肺組織。但與肝、腎等實(shí)質(zhì)器官不同，肺內(nèi)含有氣體，會阻礙低溫傳導(dǎo)，以致不能形成足夠大的冰球，難以獲得腫瘤周圍“1 cm安全邊緣”。為了克服這一障礙，有人主張?jiān)黾永鋬?復(fù)溫循環(huán)數(shù)。第1個循環(huán)冷凍復(fù)溫后，肺泡內(nèi)出血，將氣體驅(qū)除，因此再次冷凍可使冰球擴(kuò)大[10]。Izumi等[11]的實(shí)驗(yàn)顯示，應(yīng)用3 mm冷凍探針做第1個循環(huán)肺冷凍所形成的冷凍區(qū)為（3.3±1.4）cm2，而第2個循環(huán)后即增加至（10.6±3.4）cm2（P＜0.05）。Kawamura等[12]主張做3個循環(huán)冷凍-復(fù)溫。他們發(fā)現(xiàn)用2 mm或3 mm冷凍探針冷凍可形成直徑2.5 cm-3 cm冷凍區(qū)，而做3個循環(huán)冷凍-復(fù)溫后冷凍區(qū)可擴(kuò)展至4 cm。

我們應(yīng)用正常豬模型在CT引導(dǎo)下做經(jīng)皮肺冷凍實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)冰球大小隨著冷凍-復(fù)溫循環(huán)次數(shù)增加而增大，但我們也發(fā)現(xiàn)了文獻(xiàn)中從未提及的一些現(xiàn)象：①肺冷凍，不管是2個循環(huán)抑或3個循環(huán)冷凍-復(fù)溫，所產(chǎn)生的冷凍范圍（假定壞死區(qū)）在大體標(biāo)本上，均超過CT上冷凍過程中顯示的冰球大?。虎诶鋬龊蠼?，冷凍區(qū)邊緣部有活存細(xì)胞，但3天后則邊緣區(qū)均已壞死；冷凍后隨著時間延長，組織學(xué)壞死區(qū)逐步增大，3天及以后，假定壞死區(qū)在組織學(xué)上全部呈現(xiàn)壞死，兩者大小無明顯區(qū)別，換句話說，假定壞死區(qū)就是組織學(xué)壞死區(qū)。

為何肺大體上冷凍區(qū)全部獲得組織學(xué)壞死，而且范圍超過CT上顯示的冰球大小，尚難有合理解釋，可能與肺泡組織對冷凍特別敏感、易于發(fā)生壞死或凋亡有關(guān)，但也可能由于冷凍后肺泡組織的血液供應(yīng)受到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而引起次級或延遲性靶組織壞死，冷凍后隨著時間延長壞死區(qū)擴(kuò)大的事實(shí)可以此解釋。

本研究說明，經(jīng)皮冷凍肺可以達(dá)到有效破壞靶組織的目的。在技術(shù)上，以3個冷凍-復(fù)溫循環(huán)為佳；冷凍范圍不一定太大，不強(qiáng)求冷凍“1 cm安全邊緣”，以免傷及腫瘤附近器官和組織，這在冷凍治療臨近心臟和大血管的肺腫瘤時尤為重要。此外，冷凍后7天，冷凍區(qū)可見膠原生成，肺泡上皮和支氣管上皮的增生較明顯，這也是冷凍區(qū)別于射頻的優(yōu)點(diǎn)，冷凍區(qū)可以保存組織支架，有利于恢復(fù)。

如果以上發(fā)現(xiàn)能進(jìn)一步在臨床上得到證實(shí)，則在肺癌冷凍治療時，可能不一定需要把冷凍范圍擴(kuò)展到腫瘤外的“1 cm安全邊緣”，肺冷凍范圍不一定太大，只要稍微超過腫瘤本身范圍即可，特別在CT上如果冰球超過腫瘤即足夠，因?yàn)槔鋬龊蠓秶鷷U(kuò)大，這對于減少正常組織破壞、簡化治療過程和減少并發(fā)癥具有臨床價(jià)值。我們應(yīng)用經(jīng)皮冷凍治療中央型肺癌的經(jīng)驗(yàn)顯示，某些病人的腫瘤緊靠心臟或大血管，冷凍時無法獲得“1 cm安全邊緣”，但術(shù)后局部無復(fù)發(fā)，患者長期生存[13]，提示對肺癌的冷凍在技術(shù)上可能與冷凍其它實(shí)質(zhì)性腫瘤不同。