骨形成蛋白7通過激活I(lǐng)型受體BMPR1A、BMPR1B抑制肺大細胞癌NCI-H460細胞的增殖

徐慧慧 齊艷麗 頓嵩 高英 邱雪杉

BMPs是TGF-beta家族成員之一，除了在骨和軟骨的發(fā)育及誘導異位骨和軟骨發(fā)生的過程中具有重要作用外，它們還具有調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學作用[1,2]。BMP家族受體分為I型和II型，I型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A，II型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2[2]。其中I型受體決定了信號傳遞的特異性[3-5]。近年來很多研究[9-19]表明BMP7具有抑制和促進多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的雙重作用。但是，BMP7對肺癌細胞增殖的影響及其究竟是通過分別激活哪幾種I型受體抑制和促進腫瘤細胞的增殖目前尚未明確。本實驗首先檢測了BMP7對肺癌細胞增殖的影響，隨后通過在肺癌細胞系中阻斷不同的I型受體，觀察其對BMP7處理后細胞增殖作用的影響，初步探討不同的I型受體在BMP7信號傳導過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco BRL公司；重組人BMP7細胞因子購自R&D公司（克隆號：354-BP）；鼠單克隆抗人BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A抗體均購自Santa Cruz公司（克隆號：sc-73750；sc-73751；sc-73676）；RT-PCR試劑盒購自Takara公司；MTT購自Amresco公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 肺腺癌細胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長；人支氣管上皮細胞HBE在含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中貼壁生長；NCI-H460、SPC-A-1、LTEP-a-2在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中貼壁生長，均在37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）提取細胞總RNA 按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應體系為20 μL，取2 μL的RT產(chǎn)物進行PCR反應，反應體系為20 μL，BMP7引物F：5’-GGT CAT GAG CTT CGT CGT CAA CC-3’，R：5’-GCA GGA AGA GAT CCG ATT CC-3’，片段長度：235 bp，退火溫度為58oC；BMPR1A引物F：5’-TGA TTT GGA ACA GGA TGA AGC-3’，R：5’-TGT AGT ACA TTT CAG GAA GTC-3’，片段長度：382 bp，退火溫度為56oC；BMPR1B引物F：5’-GAC ACT CCC ATT CCT CAT C-3’，R：5’-GCT ATA GTC CTT TGG ATC AG-3’，片段長度：355 bp，退火溫度為55oC；ACVR1A引物F：5’-GCA TTC CCA GAG CAC CAA TC-3’，R：5’-CTG TGA GTC TTG CGG ATG GA-3’，片段長度：383 bp，退火溫度為59oC；β-actin引物F：5’-AAA TCG TGC GTG ACA TTA A-3’，R：5’-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3’，片段長度：513 bp，退火溫度為55oC。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

1.4 生長曲線測定 以1×103/孔的細胞密度，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞貼壁后，實驗組加入BMP7（100 ng/mL，對照組加入等體積PBS。每過24 h每組各取6孔細胞檢測增殖情況。每孔內(nèi)加入20 mL MTT溶液，37oC孵育4 h后，吸取培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

1.5 抗體阻斷實驗 以1×103/孔的細胞密度，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，將細胞分成6組，分別為：對照組；BMP7處理組；BMP7+BMPR1A處理組；BMP7+BMPR1B處理組；BMP7+ACVR1A處理組；BMP7+BMPR1A+BMPR1B處理組。每組設(shè)6個復孔。細胞在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、37oC培養(yǎng)箱培養(yǎng)至貼壁，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞2次，向BMP7+BMPR1A處理組、BMP7+BMPR1B處理組、BMP7+ACVR1A處理組、BMP7+BMPR1A+BMPR1B處理組分別加入經(jīng)PBS稀釋的（濃度為100 ng/mL）鼠抗人單克隆抗體BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A、BMPR1A+BMPR1B，每孔1 mL。對照組與BMP7處理組分別每孔加入等量的PBS?？贵w加入1 h后吸除，PBS洗滌2次，向各處理組中每孔加入含外源性BMP7（濃度為100 ng/mL）的上述1640培養(yǎng)液，對照組加入等量的上述1640培養(yǎng)液。每隔24 h每組各取6孔采用MTT法檢測細胞的增殖情況。連續(xù)檢測至第96 h。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，細胞實驗結(jié)果采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A在4種NSCLC細胞系和HBE細胞系中的表達情況 應用RT-PCR方法檢測4種NSCLC細胞系和HBE細胞系中不同的I型受體mRNA的表達情況，結(jié)果顯示I型受體的表達具有細胞系特異性。其中，在NCI-H460細胞系中三種I型受體均有表達，在A549、LTEP-a-2細胞系中BMPR1A、BMPR1B兩種I型受體同時表達，在HBE中僅BMPR1A一種受體表達，而在SPC-A-1中則三種受體幾乎均無表達（圖1）。

2.2 外源性BMP7對肺大細胞癌NCI-H460細胞增殖的影響 通過上述的實驗，我們篩選出同時表達三種I型受體的NCI-H460細胞作為研究對象來研究BMP7對細胞增殖的影響。首先，我們向常規(guī)培養(yǎng)的NCI-H460細胞中加入外源性BMP7（20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL）并通過MTT法檢測培養(yǎng)48 h后細胞增殖的變化情況（實驗重復3次）。結(jié)果顯示與對照組相比外源性BMP7具有顯著抑制NCI-H460細胞增殖的能力（P=0.013, P＜0.001, P＜0.001, P＜0.001），并且其抑制細胞增殖的能力具有濃度依賴性。其中BMP7濃度＞100 ng/mL時對細胞增殖的抑制最為顯著（圖2）。 隨后，我們又向常規(guī)培養(yǎng)的NCI-H460細胞中加入外源性BMP7（100 ng/mL）并通過MTT法檢測培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后細胞增殖的變化情況（每組設(shè)6個重復孔，實驗重復3次），結(jié)果顯示，BMP7抑制細胞增殖的能力亦具有時間依賴性（P=0213, P=0.023, P＜0.001, P＜0.001），其中BMP7處理第72 h時其抑制細胞增殖的能力最為顯著（圖3）。

圖 1 不同細胞中BMP I型受體mRNA的表達情況。A：BMPR1A mRNA在各細胞系中的表達情況；B：BMPR1B mRNA在各細胞系中的表達情況；C：ACVR1A mRNA在各細胞系中的表達情況。Fig 1 The mRNA expression levels of BMP type I receptors. A: Expression of BMPR1A mRNA in cell lines; B: Expression of BMPR1B mRNA in cell lines; C: Expression of ACVR1A mRNA in cell lines.

圖 2 BMP7以濃度依賴方式抑制NCI-H460細胞的增殖Fig 2 BMP7 inhibit proliferation of NCI-H460 cell in dosedependent manner

圖 3 BMP7以時間依賴方式抑制NCI-H460細胞的增殖Fig 3 BMP7 inhibit proliferation of NCI-H460 cell in timedependent manner

圖 4 特異性抗體分別阻斷BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A后BMP7抑制NCI-H460細胞增殖能力的變化情況Fig 4 The effect of BMP7 treatment on NCI-H460 cell in proliferation after blocking endogenous BMPR1A, BMPR1B and ACVR1A respectively

圖 5 特異性抗體聯(lián)合阻斷BMPR1A、BMPR1B后BMP7抑制NCI-H460細胞增殖能力的變化情況Fig 5 The effect of BMP7 treatment on NCI-H460 cell in proliferation after blocking endogenous BMPR1A and BMPR1B

圖 6 不同濃度I型抗體阻斷對BMP7抑制NCI-H460細胞增殖能力的影響情況Fig 6 The effect of anti-type I receptors at different concentrations on proliferation of NCI-H460 cell treated by BMP7

2.3 特異性抗體分別阻斷BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A、BMPR1A+BMPR1B后BMP7對NCI-H460細胞增殖的影響 為了進一步研究BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A在BMP7抑制NCI-H460細胞增殖中的作用，我們向正常培養(yǎng)的NCI-H460細胞的培養(yǎng)基中分別加入濃度為100 ng/mL的特異性抗體anti-BMPR1A、anti-BMPR1B、anti-ACVR1A、anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷內(nèi)源性I型受體，然后再向細胞中加入濃度為100 ng/mL的外源性BMP7（詳見抗體阻斷實驗），通過MTT法檢測96 h內(nèi)細胞增殖的變化情況。實驗重復3次。結(jié)果顯示與陰性對照組相比anti-BMPR1A、anti-BMPR1B、anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷組BMP7對細胞增殖的抑制能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003, P=0.014, P＜0.001），其中anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷組BMP7對細胞增殖的抑制能力幾乎減弱至0。而anti-ACVR1A阻斷組BMP7對細胞增殖的抑制能力減弱不明顯，無統(tǒng)計學意義（P=0.074）。這說明BMP7主要是通過BMPR1A、BMPR1B兩種I型受體抑制NCI-H460細胞增殖（圖4，圖5）。本實驗中三種抗體濃度的確定是依據(jù)系列滴度分析實驗，即：將細胞接種于96孔板中并將其分成對照組、BMP7處理組、BMP7+anti-BMPR（50 ng/mL）處理組、BMP7+anti-BMPR（100 ng/mL）處理組、BMP7+anti-BMPR（150 ng/mL）處理組，每組設(shè)6個復孔。按照抗體阻斷實驗中的操作方法向各處理組中依次加入相應濃度的抗體及100 ng/mL的BMP7，72 h后進行MTT實驗。實驗重復3次，結(jié)果表明anti-BMPR1A和anti-BMPR1B對BMP7信號的阻斷能力具有濃度依賴性，并且它們在濃度≥100 ng/mL時的阻斷能力尤為顯著。而anti-ACVR1A對BMP7信號的阻斷效果不顯著（圖6）。

3 討論

BMPs是TGF-beta超家族的成員，BMPs最初是從骨髓中被分離出并以其具有成骨作用而被人們所認識[1]。隨著對BMPs研究的不斷增多，人們發(fā)現(xiàn)BMPs還具有調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學作用，并在胚胎發(fā)育、器官形成過程中發(fā)揮了重要的作用[2]。BMPs通過與靶細胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，并且其受體與其它TGF-beta超家族成員分子的受體一樣，分為I型和II型，屬于絲-蘇氨酸激酶受體家族[3]。其中I型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A三個亞型，II型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2三個亞型。BMPs引起的信號傳遞需要與I型、II型受體形成復合體形式。BMPs首先與II型受體結(jié)合隨后誘導I型受體發(fā)生磷酸化，激活的I型受體迅速作用于細胞內(nèi)相應的Smads信號傳遞蛋白，通過Smads蛋白啟動信號轉(zhuǎn)導，形成有活性的復合物，進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮相應的生物學效應[4]。BMPs可以結(jié)合不同的I型受體，表現(xiàn)為信號傳遞的多樣性，且I型受體決定信號傳遞的特異性[5]。然而，另有研究證實BMPs與I型受體的結(jié)合也具有一定的選擇性，例如：BMP7傾向于與ACVR1A優(yōu)先結(jié)合，同時它與BMPR1A、BMPR1B也有一定的親和力，而BMP2、BMP4傾向于與BMPR1A結(jié)合[6-8]。但是，目前這三種BMP I型受體在BMPs信號傳遞過程中的具體作用機制尚不明確。

目前大量的研究發(fā)現(xiàn)BMPs及其受體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要而復雜的作用。首先，BMPs及其受體的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，Yang等[9]在小鼠前列腺癌模型中的研究表明：隨著病情的發(fā)展，前列腺中的BMP7表達量逐漸增加。而BMPR1A、BMPR1B的表達逐漸減少甚至消失[10]。Rothhammer等[11]的研究表明BMP7在痣、惡性黑色素瘤原發(fā)灶、惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中的表達量依次增強；BMP4在痣、惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶、惡性黑色素瘤原發(fā)灶中的表達量依次增強，并且內(nèi)源性BMP4具有促進黑色素瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移的作用；BMP7在惡性黑色素瘤中的表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)率呈正相關(guān)，BMP7表達可以作為惡性黑色素瘤進展的一個新的診斷指標[12]。Alarmo等[13]對大量乳腺腫瘤細胞系、乳腺癌組織、正常乳腺組織進行了RT-PCR檢測，分析了BMP2-BMP8及其各種受體的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系中BMP4、BMP7的表達明顯上調(diào)而BMPR（除外BMPR1B）的表達無顯著差異。值得注意的是，BMPR1B在正常乳腺組織中無表達，而在大部分乳腺癌高表達，并且ER陽性乳腺癌中BMPR1B的表達與腫瘤的高分級、高增殖能力及不良預后呈正相關(guān)[13,14]。其次，BMPs在腫瘤中發(fā)揮的生物學效應具有組織學和細胞學特異性。例如：BMP2在胰腺癌細胞中具有促進腫瘤細胞增殖的作用[15,16]，而它在乳腺癌、前列腺癌LNCaP細胞、胃MKN74細胞以及正常結(jié)腸上皮細胞中卻具有抑制增殖的作用[17-19]。另外，BMP7在前列腺BPH-1上皮細胞中具有抑制細胞增殖的作用，而在前列腺癌PC-3細胞、C4-2B細胞中卻分別具有促進侵襲轉(zhuǎn)移和抑制由血清饑餓誘導的細胞凋亡的作用[19]。綜上所述，BMPs具有促進和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的雙重作用。然而，BMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中如此復雜的生物學作用是否與BMPs分別與不同的I型受體結(jié)合后產(chǎn)生不同的生物學作用有關(guān)，目前仍未見報道，BMPs對肺癌細胞的增殖有何影響目前亦未見報道。本實驗基于BMP7能夠與三種I型受體結(jié)合的理論基礎(chǔ)，篩選出了三種I型受體均有表達的肺大細胞癌NCI-H460細胞作為研究對象，首先研究了BMP7對NCI-H460細胞增殖的作用，然后通過分別阻斷三種I型受體，研究了BMP7與不同的I型受體結(jié)合后對NCI-H460細胞增殖的影響。結(jié)果表明BMP7通過同時激活BMPR1A、BMPR1B共同抑制NCI-H460細胞的增殖。而ACVR1A在BMP7信號傳導過程中對NCI-H460細胞增殖的影響不明顯。本實驗結(jié)果為在前列腺癌中BMPR1A、 BMPR1B表達下調(diào)提供了理論依據(jù)。值得注意的是，盡管BMPR1A、BMPR1B在BMP7信號傳導過程中均具有抑制NCI-H460細胞增殖的作用，但是他們很有可能通過激活不同的信號通路共同發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。

由于本實驗涉及的細胞系非常局限，也未探討B(tài)MP7及其I型受體對肺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等生物學作用的影響，亦未排除ACVR1A在蛋白水平無表達或者即使表達也無被BMP7激活的可能性，因此還不能解釋ACVR1A在BMP7信號傳遞過程中所發(fā)揮的作用。本實驗僅為今后進一步研究BMP7在腫瘤中的作用機制奠定了部分基礎(chǔ)，也為臨床治療提供了新的可能靶點。