HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測定人血漿中恩替卡韋

郝光濤,李媛媛,何世學(xué),陳 剛,高洪志,劉澤源

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥理室,北京 100071;2.哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院,河北衡水 053000)

HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測定人血漿中恩替卡韋

郝光濤1,李媛媛1,何世學(xué)2,陳 剛1,高洪志1,劉澤源1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥理室,北京 100071;2.哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院,河北衡水 053000)

建立HPLC-MS/MS聯(lián)用方法定量測定人血漿中恩替卡韋濃度。以地西泮為內(nèi)標(biāo),甲醇為有機(jī)相,甲醇-水為(5 mmol·L-1碳酸氫銨)梯度洗脫流動(dòng)相,Waters-Eterra MS-C18(2.1×50 mm×5μm)色譜柱為分析柱,通過電噴霧離子源(ESI),以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z278.2→152.1(恩替卡韋)和 m/z285.0→193.0(地西泮,內(nèi)標(biāo))。恩替卡韋的線性范圍為0.05～20 μg·L-1,定量下限為0.05μg·L-1(n=6)。日內(nèi)、日間精密度的RSD<15%,平均回收率>75%。

恩替卡韋;高效液湘色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;血漿藥物濃度

恩替卡韋具有很強(qiáng)的抗 HBV作用,對HBV、DNA復(fù)制的起始,逆轉(zhuǎn)病和DNA正鏈合成等3個(gè)階段均起到抑制作用。恩替卡韋的作用靶點(diǎn)是HBV的DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)病酶,通過抑制這些酶,從而抑制前基因RNA逆轉(zhuǎn)病復(fù)制HBV的DNA負(fù)鏈,進(jìn)而抑制正鏈的合成,阻斷HBV的DNA鏈的延伸和裝配。恩替卡韋經(jīng)口服吸收進(jìn)入肝細(xì)胞后,通過磷酸化作用形成單磷酸脂、二磷酸脂、三磷酸脂,它們(尤其恩替卡韋三磷酸脂)是恩替卡韋在肝細(xì)胞內(nèi)抑制HBV的DNA聚合酶的活性形式。恩替卡韋比其他核苷類似物(如拉米夫定、泛昔洛韋等)更易于被磷酸化,而這可能是其對HBV有高活性的原因之一。恩替卡韋口服吸收良好,生物利用率高,達(dá)峰時(shí)間 Tmax為0.61～1 h,峰濃度Cmax為4.3～6.7 ng·mol-1,血藥溶液曲線下面積AUC為15～17.8 ng·h-1·mL-1,其組織分布廣泛,以腎臟內(nèi)濃度最高,血漿酶結(jié)合率低,恩替卡韋三磷酸脂的半衰期為14～15 h,體內(nèi)代謝率低,主要以原形從腎臟排泄。若腎功能不良,可能會(huì)影響該藥的清除。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

6410型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國Agilent公司產(chǎn)品,其中安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;串聯(lián)質(zhì)譜儀為Agilent6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,包含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測器。色譜工作站:MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件,美國Agilent公司產(chǎn)品;GL-88B旋渦混合儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;AB104電子分析天平:瑞士 Mettler Toledo公司產(chǎn)品;Sigma 2K-15型高速低溫離心機(jī):美國Sigma公司產(chǎn)品;Milli-Q Plus純水器:美國密理博中國有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

恩替卡韋對照品(含量99.68%):由中國藥品生物制品檢定所提供;地西泮對照品(內(nèi)標(biāo),批號(hào):1230-9601):由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇(色譜純):DIMA公司產(chǎn)品;乙腈(色譜純):DIMA公司產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水,本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Waters-Eterra MSC18柱 (2.1×50 mm×5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(5 mmol·L-1碳酸氫銨),梯度洗脫;流速: 0.3 mL·min-1;柱溫:20℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源 (ESI源),正離子模式檢測,多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)方式,噴射電壓5 500 V;離子源溫度350℃;源內(nèi)氣體1 (GS1,N2)壓力 2.07×105Pa,源內(nèi)氣體 2 (GS2,N2)壓力4.14×105Pa,氣簾氣 (N2)壓力6.90×104Pa,碰撞氣 (N2)壓力6.90×104Pa,碰撞電壓15 V;碎裂電壓110 V。以多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描方式分析,測定恩替卡韋和內(nèi)標(biāo)的正離子對分別為 m/z278.2→152.1,m/z 285.0→193.0,示于圖1。

圖1 恩替卡韋(a)和內(nèi)標(biāo)地西泮(b)的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full-scan product ion spectra of[M+H]+for entecavir(a)and diazepam(b)

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品預(yù)處理 精密量取50μL血漿樣品,置于1.5 mL EP試管中,分別加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液 (5μg·L-1地西泮溶液)和50μL甲醇,并補(bǔ)加1 000μL甲醇溶液,渦旋混合均勻,在4℃下以15 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液800μL,在50℃水浴中吹氮?dú)鈸]干,200 μL流動(dòng)相復(fù)溶,進(jìn)樣 10μL,HPLC-MS/MS分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱量10.0 mg(按無水計(jì)算)恩替卡韋,置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,得恩替卡韋濃度為400.0 mg·L-1,作為儲(chǔ)備液備用,然后用空白血漿依次稀釋配成濃度為0.05、0.1、0.25、1、2.5、7.5、15、20μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。按照1.4.1項(xiàng)所描述的方法進(jìn)行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.25、2.5、15μg·L-1的質(zhì)控樣品。

1.4.3 穩(wěn)定性考察 在不同的實(shí)驗(yàn)條件下對質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(n=3)。

1)質(zhì)控樣品在-40℃冰箱中完全冷凍后取出,在室溫環(huán)境下解凍,然后再次放入冰箱,如此反復(fù)3次后制備并測定;

2)質(zhì)控樣品在室溫下放置 4 h后制備并測定;

3)質(zhì)控樣品在-40℃下避光保存,1個(gè)月后制備并測定;

4)質(zhì)控樣品在進(jìn)樣器放置 4 h后制備并測定。

2 方法與結(jié)果

2.1 特異性考察

分別取6個(gè)不同受試者的50μL空白血漿,除不加入內(nèi)標(biāo)溶液并補(bǔ)加50μL甲醇外,其余按血漿樣品分析方法處理,進(jìn)樣10μL,獲得空白樣品的色譜圖,示于圖2a;將一定濃度的恩替卡韋標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)地西泮溶液加入空白血漿中,依同法進(jìn)行樣品處理,獲得相應(yīng)的色譜圖,示于圖2b(最低定量限)、圖2c(標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度);取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法進(jìn)行樣品處理,獲得相應(yīng)的色譜圖,示于圖2d。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾恩替卡韋和地西泮的測定。

2.2 相對基質(zhì)效應(yīng)考察

分別取6個(gè)不同受試者的50μL空白血漿于1.5 mL EP試管中,然后各加入50μL恩替卡韋最低濃度 (0.05μg·L-1)標(biāo)準(zhǔn)溶液和50 μL內(nèi)標(biāo),按1.4.1項(xiàng)操作,進(jìn)樣量10μL,每個(gè)空白血漿做3份;并同時(shí)做1條隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品的實(shí)測濃度。結(jié)果顯示,所有實(shí)驗(yàn)測定值與標(biāo)示量的相對偏差均在±20% 之間,精密度為 10.04%(小于15%),可認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以待測化合物和內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),權(quán)重系數(shù)1/X2,進(jìn)行線性回歸計(jì)算,得標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖 3。線性相關(guān)系數(shù) r為0.996 4,而且各點(diǎn)標(biāo)示濃度和計(jì)算濃度的偏差都在±15%以內(nèi)(最低定量限為±20%),最低定量濃度為0.05μg·L-1。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

方法學(xué)考核濃度為0.25、2.5、15μg·L-1, n=6,(方法學(xué)考核批次)為3次,結(jié)果列于表1。結(jié)果表明,此方法的精密度和準(zhǔn)確度偏差均在±15%以內(nèi)。

2.5 穩(wěn)定性

分別在-40℃反復(fù)凍融3次、血漿室溫放置4 h、-40℃下凍存1個(gè)月、進(jìn)樣器放置4 h (n=3),4種條件下考察方法的穩(wěn)定性,結(jié)果列于表2。結(jié)果表明,恩替卡韋在這4種條件下的穩(wěn)定性良好。

2.6 相對回收率試驗(yàn)

取1.5 mL EP試管數(shù)支,制備含恩替卡韋濃度分別為0.25、2.5、15μg·L-1的質(zhì)控樣品,按1.4項(xiàng)操作,記錄色譜圖,計(jì)算恩替卡韋峰面積 As和內(nèi)標(biāo)峰面積 Ai的比值 f,將 f代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算實(shí)測濃度與加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度 (相對回收率),結(jié)果顯示,低、中、高濃度的相對回收率分別為 107.33%、102.47%、105.22%。

2.7 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法測定36名中國成年健康志愿者單劑量口服1 mg恩替卡韋后,不同時(shí)間血漿中恩替卡韋的濃度,并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。平均血藥濃度-時(shí)間曲線示于圖4。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果為 Cmax:(7.63±1.91)μg·L-1;Tmax: (0.67±0.22)h;t1/2:(62.35±22.36)h; AUC0-tn:(22.80±4.19)μg·h·L-1;AUC0-∞: (29.08±4.57)μg·h·L-1。

圖2 血漿中恩替卡韋(Ⅰ)和內(nèi)標(biāo)地西泮(Ⅱ)的典型MRM色譜圖a.空白血漿色譜圖; b.空白血漿中加入0.05μg·L-1恩替卡韋和5μg·L-1內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖; c.空白血漿中加入2.5μg·L-1恩替卡韋和5μg·L-1內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖; d.志愿者口服1 mg恩替卡韋0.75 h后的血漿樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of entecavir(I)and diazepam(IS)(II)in humen plasma a.blank plasma;b.standard curve sample(0.05μg·L-1)added IS(5μg·L-1); c.standard curve sample(2.5μg·L-1)added IS(5μg·L-1); d.plasma sample from a healthy volunteer 0.75 h after oral administration of 1 mg entecavir

圖3 HPLC-MS/MS法測定人血漿中恩替卡韋的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The typital calibration cure for entecavir in human plasma

表1 恩替卡韋回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of entecavir

表2 恩替卡韋穩(wěn)定性Table 2 Stability of entecavir

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立了血漿中恩替卡韋的 HPLCMS/MS測定法,血漿中的雜質(zhì)不干擾樣品的測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.05～20μg·L-1,線性關(guān)系良好;高、中、低3個(gè)濃度的批內(nèi)和批間精密度均小于15.0%;相對回收率在102.47%～107.33%之間;恩替卡韋血漿樣品室溫放置 4 h,-40℃下反復(fù)凍融3次,-40℃下凍存1個(gè)月及檢測樣品進(jìn)樣器放置4 h條件下的穩(wěn)定性良好,符合生物樣品分析要求。采用沉淀蛋白法后揮干的方法處理血漿樣品,相比固相萃取法操作簡單,節(jié)約成本,最低定量限為50 pg,滿足本研究藥代數(shù)據(jù)的需要。

圖4 36名健康志愿者口服1 mg恩替卡韋后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.4 Mean plasma concentration-time profile of amycin in 36 healthy volunteers after oral administration of 1 mg entecavir

[1]YAN J H,BIFANO M,OLSEN S,et al.Entecavir pharmacokinetics,safety,and tolerability after multiple ascending doses in healthy subjects[J]. The Journal of Clinical Pharmacology,2006,46: 1 250-1 258.

[2]MA TUSZEWSKI B K,CONSTANZER M L, CHAVEZENG C M.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J].Anal Chem, 2003,75(13):3 019-3 030.

[3]ZOULIM F.Entecavir:A new treatment option for chronic hepatitis B[J].Journal of Clinical Virology,2006,36(1):8-12.

[4]SHERMAN M,YURDAYDIN C,SOLLANO J. Entecavir for treatment of lamivudine-refractory, HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].Gastroenterology,2006,130(7):2 039-2 049.

[5]CHANG T T,GISH R G,HADZIYANNIS S J, et al.A dose-ranging study of the efficacy and tolerability of entecavir in lamivudine-refractory chronic hepatitis B patients[J].Gastroenterology, 2005,129(4):1 198-1 209.

Quantitative Determination of Entecavir in Human Plasma by HPLC-MS/MS

HAO Guang-tao1,LI Yuan-yuan1,HE Shi-xue2,CHEN Gang1, GAO Hong-zhi1,LIU Ze-yuan1
(1.A f f iliated Hospital,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100071,China; 2.Harrison International Peace Hospital,Hengshui053000,China)

Entecavir in human plasma was determined by high performance liquid coupled with-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Diazepam was used as internal standard. Entecavir was separated on a Waters-Eterra MS-C18column(2.1×50 mm×5μm).Electrospray ionization(ESI)source was applied,and multiple reaction monitoring(MRM)mode was operated in the positive mode with the monitor ions atm/z278.2→152.1 for entecavir andm/z285.0→193.0 for the internal standard,respectively.The linear calibration curve is obtained over the concentration range of 0.05—20μg·L-1.The limit of quantitation is 0.05μg·L-1(n=6).The inter and intra-day precision(RSD)is less than 15%.The average recoveries are above 75%.

entecavir;high performance liquid chromatography coupled with-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);plasma concentration

O 657.63;R 927.2

A

1004-2997(2010)04-0252-05

2009-10-21;

2010-02-02

郝光濤(1980～),男(漢族),甘肅慶陽人,藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13146323056@m165.com

劉澤源(1961～),男(漢族),山西太原人,主任藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13311010528@m165.com