包埋吸附法固定化酒用酸性脲酶的研究

吳召慧, 田亞平

(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

包埋吸附法固定化酒用酸性脲酶的研究

吳召慧, 田亞平＊

(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

用包埋吸附法固定化酒用酸性脲酶,探討了固定化的條件、固定化酶的部分性質以及固定化酶在黃酒中的應用。結果表明:固定化酒用酸性脲酶的最適海藻酸鈉濃度、CaCl2質量濃度和殼聚糖濃度分別為2.0、5.0和0.3 g/dL,最適固定化時間為2.5h,固定化率為82.3%;最適反應溫度40℃、最適p H4.0、半衰期為48d,固定化酶的比活為3.6 U/mg;在35℃下添加量為0.1 g/mL (固定化酶質量/黃酒體積),24 h內黃酒尿素去除率達65%,同樣條件下連續(xù)使用去除黃酒中尿素,使用13次時尿素去除率達39.7%。

酸性脲酶;吸附包埋;黃酒;尿素去除率

脲酶是一種催化尿素水解為氨和CO2的高度專一性酶,尿素的酶促水解速度是非酶水解速度的1014倍。根據(jù)脲酶的最適作用p H,可以將脲酶分為酸性、中性和堿性。酸性脲酶能夠耐受酸性環(huán)境,并且其中有些酸性脲酶在低乙醇度酒精飲料中仍具有很高的活性,因而可以用來去除酒精飲料中所含有的尿素[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)90%的氨基甲酸乙酯(簡稱EC,一種致癌物質)是尿素和乙醇經化學反應后生成的產物[3],向酒中添加酸性脲酶是降低酒中尿素含量最為簡便、實用,也是目前較常用的方法[4],近年來OIV(國際葡萄·葡萄酒組織)、澳大利亞、新西蘭和日本等國家都相繼通過了允許添加酸性脲酶降低酒中尿素的決議[5]。游離酶在溶液中不穩(wěn)定,容易變性和失活,反應后酶難以分離回收,無法重復使用,利用固定化酶可避免以上的不足,擴大了酶的使用范圍。國內外研究報道各種不同的固定化脲酶還可用于醫(yī)療診斷[6],環(huán)境監(jiān)測,工業(yè)生產等領域。

2006年本課題組通過篩選獲得了一株酸性脲酶產生菌Enterobactriasp.R2SYB082,并對發(fā)酵生產條件及粗酶在黃酒中的應用進行了研究[7]。在此基礎上,作者通過包埋吸附法制備固定化酒用酸性脲酶,利用殼聚糖和海藻酸鈉在一定條件下可以形成穩(wěn)定的聚電解質化合物[8]固定該酶,以減少酶的泄露,且海藻酸鈉和殼聚糖對環(huán)境和人體沒有危害,對酒的安全性沒有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酸性脲酶 作者所在實驗室制備所得。

1.1.2 試劑 海藻酸鈉:化學純,中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司;氯化鈣:分析純,中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司;殼聚糖(脫乙酰度,90%):山東奧康生物科技有限公司;二乙酰一肟:上?；瘜W試劑廠生產;硫代氨基脲:上海化學試劑廠產品。其余為國產分析純試劑。

1.1.3 儀器 722光柵分光光度計:上海第三分析儀器廠生產;PHS-25型p H計:上海雷磁儀器廠生產;TG-328A電光分析天平:梅特勒公司產品。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定方法

1)游離酶活測定 采用靛酚藍反應采用比色法,見參考文獻[9]。

酶活力定義:在常壓,37℃,p H5.5條件下,每分鐘分解底物產生1μmol氨為一個酶活力單位。

2)固定化酶活測定 一定體積的酶液經固定化后加入一定體積的檸檬酸緩沖液配制的pH值5.5的體積分數(shù)為3%尿素溶液在37℃恒溫水浴箱中保溫30 min后,過濾取濾液,下面方法與游離酶活力測定相同。為便于考察變量對固定化酶活的影響,以同組實驗中酶活最高位100%,進行數(shù)據(jù)處理。

3)尿素去除率的測定方法:二乙酰一肟法,見參考文獻[10]。

1.2.2 固定化方法 稱取一定質量的海藻酸鈉溶于一定體積的酶液中,混勻后靜置一段時間至溶液中無氣泡,用注射器注射入含有一定濃度殼聚糖的一定濃度的CaCl2溶液中,振蕩一定時間后,用去離子水洗滌3次,濾干水分。4℃冰箱保藏備用。

2 結果與分析

2.1 固定化酶的制備

2.1.1 海藻酸鈉質量濃度對固定化酒用酸性脲酶的影響 海藻酸鈉在固定化過程中主要起包埋酒用酸性脲酶的作用,實驗考察了其濃度對固定化小球的強度,成球難易程度,成球形狀,固定化酶的酶活等的影響,結果見表1和圖1。

表1 海藻酸鈉質量濃度對固定化小球的影響Tab.1 Effect of sodium alginate concentration on the forming process of immobilization granule

表明固定化酒用酸性脲酶的合適海藻酸鈉質量濃度為2.0 g/dL。海藻酸鈉質量濃度增加導致凝膠強度逐漸加強,但溶液中的氣泡也有所增加,當海藻酸鈉濃度大于2.0 g/dL時,小球形狀趨于不規(guī)則。此濃度下的固定化小球的圖片見圖2,固定化酸性脲酶的固定化率為82.3%,固定化率可能是因為部分酶粘在器皿壁上未能制成固定化小球和固定化酶的空間位阻效應共同作用的結果。

圖1 海藻酸鈉和C aCl2質量濃度對固定化酶活力的影響Fig.1 Effect of sodium alginate and calcium chloride concentration on immobilizedacid urease activity

圖2 固定化小球的圖片F(xiàn)ig.2 The picture of immobilization beads

2.1.2 CaCl2質量濃度對固定化酒用酸性脲酶酶活的影響 CaCl2質量濃度影響固定化小球的強度,有研究報道高濃度的Ca2+往往對酒用酸性脲酶酶活有抑制作用[11],圖1結果表明,固定化酒用酸性脲酶的最適CaCl2質量濃度為5.0 g/dL。

2.1.3 殼聚糖質量濃度對固定化酒用酸性脲酶酶活的影響 殼聚糖對固定化酶活影響見圖3。圖3結果顯示固定化酒用酸性脲酶的最適殼聚糖質量濃度為0.3 g/dL。殼聚糖對脲酶有吸附作用,隨著殼聚糖的增加附著的酶有所增加,但過高質量濃度的殼聚糖會在小球表面形成一層致密的膜,反而阻礙底物的擴散。

2.1.4 時間對固定化酒用酸性脲酶酶活的影響時間對酶性脲酶活影響見圖4。從圖4可以看出,固定化的最適時間為2.5 h,隨著固定化時間的增加,載體的硬度也隨之增大。這是由于固定化時間越長,海藻酸鈉與氯化鈣的反應就越完全,形成的海藻酸鈣凝膠珠就越致密。

圖4 固定化時間對固定化酒用酸性脲酶酶活的影響Fig.4 Effect of immobilized time on immobilized acid urease activity

2.2 固定化酒用酸性脲酶性質的研究

2.2.1 固定化酒用酸性脲酶的貯存穩(wěn)定性 將游離酶和固定化酶放于4℃冰箱中,每隔3 d分別測定酶活見圖5。由圖5可以看出:游離酶放置26 d后酶活下降一半,而固定化酶的半衰期為48 d,說明固定化酶的貯存穩(wěn)定性較游離酶又所加強。

圖5 固定化酸性脲酶與游離酶的貯存穩(wěn)定性Fig.5 Effect of storage time on enzyme activity of free acid urease and immobilized acid urease

2.2.2 固定化酒用酸性脲酶的最適反應溫度 最適反應溫度見圖6。從圖6得出:固定化酶的酶活在40℃達到最大,而游離酶最適反應溫度為35℃。從固定化酶,游離酶的比較圖中可以看出,固定化酶有較高的相對活力的溫度范圍比游離酶大。酸性脲酶固定化以后最適反應溫度有所提高。

2.2.3 固定化酒用酸性脲酶的最適p H 最適p H見圖7。圖7表明:固定化酒用酸性脲酶的酶活在p H 3～5范圍相對穩(wěn)定,最適p H為4。相對于游離酶的p H 5.5的最適p H值,固定化酒用酸性脲酶的最適p H向酸性區(qū)域發(fā)生了遷移,p H穩(wěn)定性也有所提高。說明酶固定化后催化性質發(fā)生了改變,且各種黃酒的p H都在4左右,該脲酶在固定化后更適合在黃酒中發(fā)揮作用。

圖6 溫度對游離酶和固定化酶酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity of free acid urease and immobilized acid urease

圖7 pH對游離酶和固定化酶酶活的影響Fig.7 Effect of pHon enzyme activity of free acid urease and immobilized acid urease

2.2.4 固定化酒用酸性脲酶的溫度穩(wěn)定性 其酶活的溫度穩(wěn)定性見圖8。由圖8可以看出:固定化酒用酸性脲酶在25～55℃之間酶有較好的熱穩(wěn)定性,相對酶活都在80%以上。當酶液在較高溫度(65℃)時,保存3 h相對酶活仍在70%左右。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)游離酶在65℃時保存3 h相對酶活僅有40%左右,固定化酶比游離酶有較好的熱穩(wěn)定性。

圖8 固定化酸性脲酶溫度穩(wěn)定性Fig.8 The temperature stability of immobilized acid urease

2.2.5 固定化酒用酸性脲酶的p H穩(wěn)定性 酶活最適pH值見圖9。由圖9可以看出:固定化酒用酸性脲酶在pH 3～6.5之間有較好的穩(wěn)定性,酶活都保持在80%以上,當pH值高于7時酶活損失比較大。

圖9 固定化酸性脲酶的pH穩(wěn)定性Fig.9 The pHstability of free acid urease and immobilized acid urease

2.3 固定化酒用酸性脲酶去除黃酒中的尿素

固定化酒用酸性脲酶用于去除黃酒中的尿素,在35℃,添加量為0.13 U/mL時,每隔24 h測定尿素去除率見圖10。從結果可以看出尿素去除效果在前3 d內比較明顯,24 h后酒樣1和酒樣2的尿素去除率分別達到65%和62%,前3 d酒樣1和酒樣2的尿素去除率分別達到77%和80%,同樣條件下,在連續(xù)使用13次后其尿素去除率為39.7%,即重復反應13次后尿素去除率降低一半左右,結果見圖11。

圖10 固定化酒用酸性脲酶的尿素去除率Fig.10 The urea removal rate of immobilized acid urease

圖11 連續(xù)使用13次固定化酒用酸性脲酶的尿素去除率Fig.11 The urea removal rate of immobilized acid urease continuous using thirteen times

3 結 語

用包埋吸附法固定化酒用酸性脲酶,所用的材料海藻酸鈉和殼聚糖都是對人體無害的物質,且固定化酶的制備成本低,過程簡單,條件溫和。固定化酶在酒類飲料中使用后不影響酒類飲料的飲用,可以多次去除其中的微量尿素,方便回收。但此方法在使用的強度和穩(wěn)定性方面距工業(yè)應用還有一定的距離,還有待于進一步改進。

[1]Kobashi K,Takabe S.Removal of urea f rom alcoholic beverages with an acid urease[J].Appl Toxi,1988,8(1):73-74.

[2]Yoshizawa K,Takahashi K.Utilization of urease for decomposition of urea in sake[J].Brew Soc Japan,1988,83(2): 142-144.

[3]Yoshizawa K,Takahshi K.Efeecets of temperature and sake components on the production of ethylcarbamate.[J].Brew Soc Japan,1988,83(1):69-73.

[4]陸健.酒精飲料中的氨基甲酸乙酯[J].江蘇食品與發(fā)酵,1994,3:27-29.

LUjian.Urethan in alcoholic beverage[J].Jiangsu Food and Fermentation,1994,3:27-29.(in Chinese)

[5]Kakimoto S,Sumino Y.Purification and characterization of acid urease fromL actobacillus f ermentum[J].Appl Microbiol Biotechnol,1990,32:538-543.

[6]Butzke C E,Bisson L F.Ethyl carbamate preventative action manual[M].US:Food and drug Administ ration,1997:7.

[7]王玉美,田亞平,趙光鰲,等.腸桿菌酸性脲酶的提取及基本特性[J].食品工業(yè)科技,2007(4):178-180.

Wang Yu-mei,Tian Ya-ping,Zhao G A.The extraction and characterization of an acid urease f romEnterobactersp[J]. Science and Tecnology of Food Industry,2007(4):178-180.(in Chinese)

[8]Filiz Kara,Gǒkhan Demirel,Hayrettin Tümtürk.Immobilization of Urease by Using Chitosan-Alginate and Poly(Acrylamidco-Acrylic Acid)/k-carrageen an Kupports[J].Bioprocess and Engineering,2006,29(3):207-211.

[9]Kaplan A.Methods of biochemical analysis[M].New York,1965.17:311.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部.游泳用水水質檢驗方法[S].1985.10-11.

[11]楊魯強,王松華,田亞平等.酒用酸性脲酶的純化及其N端序列的測定[J].食品與生物技術學報.2008(11):93-97.

YANGLu-qiang,WANG Song-hua,TIAN Ya-ping.Purification and N-terminal analysis of an acid urease[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008(11):93-97.(in Chinese)

(責任編輯:楊萌)

Immobilization of Acid Urease Via Adsorption and Embedded

WU Zhao-hui, TIAN Ya-ping＊
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The immobilization conditions,and application acid urease via adsorption and embedded were investigated in this study.The optimum concentration of sodium alginate,calcium chloride and chitosan was 2.0,5.0 and 3.0 g/dL,respectively.the optimal immobilized time was 2.5h, the immobilization rate was 82.3%,and the reaction take place at 40℃and p H4.The half-lives of immobilized acid urease was 48 days,the unit of immobilized urease was 3.6U/mg,the urea removal rate was 65%at 35℃,24 h and the addition level of immobilized acid urease was 0.1g/ mL(the quality of immobilized enzyme/the volume of Chinese rice wine),under the same conditions,the urea removal rate still reached at 39.7%under the continuous using thirteen times.

acid urease adsorb,embed rice wine,urea removal rate

TS 201.2

:A

1673-1689(2010)03-0437-05

2009-04-20

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2007BA K36B02)。

＊通信作者:田亞平(1964-),女,安徽淮南人,工學博士,教授,博導,主要從事生物活性物質方面的研究。Email:yapingtian@hotmail.com