產(chǎn)大環(huán)糊精4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及其性質(zhì)研究

冀雪霞, 王金鵬, 徐學(xué)明, 金征宇＊

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

產(chǎn)大環(huán)糊精4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及其性質(zhì)研究

冀雪霞1,2, 王金鵬1,2, 徐學(xué)明1,2, 金征宇＊1,2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠作用直鏈淀粉產(chǎn)生大環(huán)糊精。作者研究了重組E.coliDH-5α-TA(保藏編號(hào):3093)產(chǎn)生的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)。粗酶液經(jīng)過65℃處理20 min、Ni -NTA親和層析、生物半透膜脫鹽得到目標(biāo)酶,該酶經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳呈單一蛋白條帶,其相對(duì)分子質(zhì)量為57 000。該酶具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性且最小作用底物為麥芽糖。酶學(xué)性質(zhì)研究表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為75℃,最適p H值為7.5;該酶具有良好的耐熱性,在70～85℃酶活維持在80%以上;酶的p H穩(wěn)定范圍為6.0～8.5。

4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶;大環(huán)糊精;分離純化;酶學(xué)性質(zhì)

環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是由芽孢桿菌屬(Bacillus)的某些種產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)作用于淀粉而生成的一類環(huán)狀低聚糖,其中最常見的是聚合度分別為6、7和8的α-、β-和γ-環(huán)糊精[1-2]。區(qū)別于上述環(huán)糊精的大環(huán)糊精是指聚合度從9到幾百不等的環(huán)狀葡聚糖[3-4],由于其復(fù)雜的空穴結(jié)構(gòu)、高水溶性、低黏度和不回生等特性,可以廣泛地用于食品、化學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)中,越來越多的學(xué)者開始關(guān)注并致力于大環(huán)糊精的研究[5-8]。

環(huán)糊精的生產(chǎn)通過生物酶法進(jìn)行的,即由微生物來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGTase, EC 2.4.1.19)轉(zhuǎn)化淀粉而得[2,9-11],其中用于制備大環(huán)糊精的酶是4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶(4-α-GTase,EC 2.4.1.25)[12-13]。該酶是一個(gè)多功能性酶(Nakamura et al.1994),屬于α-淀粉酶家族[3,14],可以作用直鏈淀粉使其發(fā)生環(huán)化反應(yīng),生成α-1,4-葡聚糖,即大環(huán)糊精(Takaha et al.1996,1998)。盡管從眾多微生物或植物中都可以得到該酶[9,15-16,21],但是由于其在生物體內(nèi)的含量很低,無論是作為研究來源還是用于制備大環(huán)糊精,都不能滿足需求[7,17]。國(guó)外對(duì)產(chǎn)大環(huán)糊精的糖基轉(zhuǎn)移酶的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年,而國(guó)內(nèi)僅近幾年才開始進(jìn)行研究[4,19],對(duì)于產(chǎn)大環(huán)糊精酶的研究成果很少。

作者利用實(shí)驗(yàn)室保存的一株基因工程菌E.coliDH-5α-TA發(fā)酵產(chǎn)4-α-CGTase,對(duì)該酶進(jìn)行了分離、純化和鑒定,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,為該酶進(jìn)一步的研究以及大環(huán)糊精的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 重組E.coliDH-5α-TA,帶有p6× HTAaGT Ampr質(zhì)粒(質(zhì)粒為韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)Kwan-Hwa Park教授提供)。

1.1.2 培養(yǎng)基LB斜面培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,瓊脂20,氨芐青霉素0.1, p H7.5;LB種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl10,氨芐0.1,p H 7.5;LB發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10,氨芐0.1,p H 7.5。

1.1.3 主要試劑 低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白:14 400～97 400,分析純,重慶升博科技有限公司產(chǎn)品; SDS-PAGE試劑:分析純,北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;麥芽糖標(biāo)樣、三(羥甲基)氨基甲烷:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要設(shè)備 SW-CJ-1F雙人單面超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;LS-B50L自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品;3K30冷凍離心機(jī):SIGMA公司產(chǎn)品;J YD-650超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):上海三信儀器有限公司產(chǎn)品;純泰PURIBEST Ni-NTA親和層析柱:生物醫(yī)藥純化技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái);SDS-PAGE電泳儀:伯樂公司產(chǎn)品;HPLC:LC-20AT(包括二元泵,手動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,示差折光檢測(cè)器),日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌體的收集

1)種子培養(yǎng) 將穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌種從平板上挑取單菌落接種至裝有80 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng),設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為200 r/ min,37℃培養(yǎng)12h。

2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按照2%(體積比)的接種量,接種至裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,設(shè)置轉(zhuǎn)速200 r/min, 37℃發(fā)酵培養(yǎng)10 h。

3)收集菌體 將發(fā)酵完成的菌液于10 000 r/ min離心10 min收集菌體,用50 mmol/L Tris-HCl (p H 7.5)洗滌細(xì)胞兩次,徹底去除殘余培養(yǎng)基,上清液即為粗酶液。

1.2.2 粗酶液的制備 將濕菌體充分均質(zhì),冰浴超聲。程序?yàn)槌暡üβ?00 W,處理2 s,間隔5 s,循環(huán)100次。然后將其混合液于4℃,10 000 r/ min離心10 min,上清液即為粗酶液[17]。

1.2.3 酶活分析 碘比色法:準(zhǔn)確吸取250μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%直鏈淀粉(DMSO),置入10 mL比色管中,加50μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%麥芽糖(Tris-HCl,p H 7.5),600μL 50 mmol/L Tris-HCl(p H 7.5),搖勻。于75℃水浴預(yù)熱10 min,準(zhǔn)確加入0.1 mL酶液,搖勻,立即計(jì)時(shí),于75℃水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)10 min,立即取出100μL反應(yīng)液加入到900μL稀碘液,搖勻即可終止反應(yīng)。以稀碘液為空白,620 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[18]。

酶活定義:在測(cè)定條件下,10 min內(nèi)吸光度每下降0.1為一個(gè)酶活單位。

1.2.4 目標(biāo)酶的分離純化

1)酶的初步純化 將粗酶液置于65℃處理20 min,然后4℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液[10],這樣以使其中大部分的不耐熱的酶變性而沉淀,為進(jìn)一步的分離純化提供了方便。

2)Ni-NTA柱親和層析 所表達(dá)的基因工程重組蛋白帶有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽,可用Ni-NTA樹脂柱進(jìn)行親和層析純化。將粗酶液經(jīng)微孔膜過濾后注入平衡好的Ni-NTA親和層析柱,上樣完畢后靜置2 h,以便His-tag標(biāo)簽與填料中Ni2+充分結(jié)合。先用4 mL洗滌緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(p H 7.5),300 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑]洗滌過柱以洗去未結(jié)合的雜蛋白,再用洗脫緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(p H 7.5),300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑]來洗脫下與親和柱結(jié)合的目標(biāo)蛋白,此時(shí)收集目的酶液。

3)透析脫鹽處理 將半透膜制成袋狀,將粗酶液置入袋內(nèi),將此透析袋浸入去離子水中,樣品液中的大相對(duì)分子質(zhì)量的生物大分子被截留在袋內(nèi),而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外,用磁力攪拌每隔4 h更換一次去離子水,直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。

1.2.5 目標(biāo)酶的鑒定

1)SDS-PAGE鑒定酶的純度和測(cè)定酶的分子量 SDS-PAGE凝膠電泳可以鑒定酶的純度并測(cè)定其分子量。采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng),對(duì)純化后的目標(biāo)酶進(jìn)行純度鑒定[18,21]。分離膠質(zhì)量濃度15 g/dL,濃縮膠質(zhì)量濃度5 g/dL,電泳采用p H 7.5的Tris-HCL緩沖體系,考馬斯亮藍(lán)R-250染色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker與樣品的SDS-PAGE圖比較來判斷目標(biāo)酶的純度及其相對(duì)分子質(zhì)量大小。

2)HPLC分析 酶的轉(zhuǎn)糖基活性表現(xiàn)在能否將一種底物(糖)轉(zhuǎn)移到另一種底物(糖)分子上。作者用HPLC法在平衡條件下測(cè)定底物(葡萄糖、麥芽糖、麥芽四糖混合物)及其酶解產(chǎn)物中各個(gè)成分的變化情況,為該酶的作用情況提供參考并為以后酶的應(yīng)用工作提供了依據(jù)和方法。分別向葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖中添加等量的酶,75℃保溫20 min,100℃加熱滅活10 min,最后用0.45μm微濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。色譜條件:采用糖柱,柱溫85℃,流動(dòng)相為超純水,流速4 mL/min,進(jìn)樣量10μL,等梯度洗脫。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1)不同溫度對(duì)其酶活的影響為了確定酶的最適反應(yīng)溫度,將酶與底物在p H7.5及不同溫度40～100℃條件下反應(yīng),反應(yīng)10 min后分別測(cè)其酶活,以最高的酶活力為100%,其余條件下的酶活與其比值換算成相對(duì)酶活。

2)不同p H對(duì)其酶活的影響由于酶與緩沖液p H有關(guān),所以在分別將緩沖液的p H值調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時(shí),當(dāng)p H介于4.0～6.0使用50 mmol/L醋酸鈉緩沖液作為緩沖體系;當(dāng)p H介于6.0～7.0使用磷酸鈉緩沖液;當(dāng)p H介于7.0～8.0使用Tris-HCl(p H 7.5)緩沖液作為緩沖體系;當(dāng)p H介于8.0～10.0使用氨基乙酸-氫氧化鈉緩沖液作為緩沖體系;當(dāng)p H介于10.0～11.0使用碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液作為緩沖體系,在75℃下反應(yīng)10 min確定各自的酶活,以最高的酶活力為100%,其余條件下的酶活與其比值換算成相對(duì)酶活[17]。

3)溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性影響在相對(duì)穩(wěn)定的p H 7.5下,使酶在某個(gè)溫度下保溫不同時(shí)間測(cè)定其酶活,以最高的酶活力為100%,其余條件下的酶活與其比值換算成相對(duì)酶活。

4)p H值對(duì)酶的穩(wěn)定性影響將酶液分別加入到p H 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖體系中室溫放置2 h,然后調(diào)回最適pH值,在常規(guī)條件反應(yīng)體系中(75℃)測(cè)定殘余酶活,以最高的酶活力為100%,其余條件下的酶活與其比值換算成相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

圖1 目標(biāo)酶的Ni-NTA親和層析柱洗脫曲線Fig.1 Elution curves of purified enzyme on Ni-NTA column

2.1 酶的分離純化

2.1.1 酶的初步純化 由于目標(biāo)酶耐熱,所以經(jīng)過65℃保溫20 min處理,可以去除一部分不耐熱的雜蛋白。

2.1.2 Ni-NTA親和層析純化目標(biāo)蛋白 由圖1中可以看出,粗酶液中蛋白種類較雜,組分較多。經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱分離得到明顯的5個(gè)活力峰,即1、2、3、4、5,由1、2、3、4組成的巨大峰為雜蛋白的峰,而5為與Ni-NTA柱耦合后被洗脫液洗洗脫下的目標(biāo)酶峰。

圖2 分離純化的目標(biāo)酶電泳圖Fig.2 SDS-PAGEanalysis of the purified enzyme

2.1.3 SDS-PA GE分析 分離純化的目標(biāo)酶經(jīng)處理后,用SDS-PAGE電泳來對(duì)其進(jìn)行純度與相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過初步純化(65℃,20 min保溫)、親和層析和透析脫鹽,目標(biāo)酶在SDS-PAGE凝膠中被鑒定為電泳純,相對(duì)分子質(zhì)量57 000。 2.1.4 HPLC分析酶促反應(yīng)混合物 采用HPLC法對(duì)底物及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3～6所示,圖中,A1為葡萄糖,B1為麥芽糖,C1為麥芽低聚糖,D為純酶,A2為經(jīng)過酶處理的葡萄糖,B2為經(jīng)過酶處理的麥芽糖,C2為經(jīng)過酶處理的麥芽低聚糖。圖3為葡萄糖標(biāo)樣、麥芽糖標(biāo)樣、麥芽四糖混合物標(biāo)樣的HPLC圖,由此可知對(duì)應(yīng)組分的保留時(shí)間。為其保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的組分分析。根據(jù)保留時(shí)間定性,可知葡萄糖為底物反應(yīng)前后(圖4)無變化;

以麥芽糖為底物反應(yīng)后(圖5)生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖;

以麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后(圖6)生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖。

圖3 底物標(biāo)樣的HPLC圖Fig.3 Standard samples of the substraates

圖4 HPLC分析酶促反應(yīng)混合物(葡萄糖+純酶)Fig.4 HPLC analysis of the reaction mixture(Glucose +Purified Enzyme)

圖5 HPLC分析酶促反應(yīng)混合物(麥芽糖+純酶)Fig.5 HPLC analysis of the reaction mixture(Maltose +Purified Enzyme)

圖6 HPLC分析酶促反應(yīng)混合物(麥芽低聚糖+純酶)Fig.6 HPLCanalysis of the reaction mixture(Maltotriose&Maltoterraose+Purified Enzyme)

由此可以看出,該酶對(duì)葡萄糖沒有轉(zhuǎn)糖基活性,最小作用底物是麥芽糖。4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠作用麥芽糖及麥芽四糖混合物生成麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖等,這表明該酶具有良好的轉(zhuǎn)糖基活性。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.1 最適溫度的研究 溫度高于最適溫度時(shí),引起的酶變性而降低反應(yīng)速度;在溫度低于最適溫度時(shí),酶的反應(yīng)速度隨著溫度升高而增加,所以為了確定酶的最適反應(yīng)溫度,研究了一定時(shí)間內(nèi)溫度對(duì)酶活性的影響。如圖7所示,該酶隨著溫度的增加酶活呈上升趨勢(shì),約到75℃酶活達(dá)到最高,溫度超過75℃后酶活開始下降,得知其最適溫度為75℃,且在50～85℃范圍內(nèi)酶活都可以達(dá)到80%以上,可見該酶為耐熱酶,至100℃時(shí)仍剩下20%左右的酶活。溫度對(duì)該酶的影響結(jié)果與Jin-Hee Park[15]、王水興[21]等人研究基本一致。

圖7 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.7 E ffects of temperature on the specific enzymeactivity

圖8 pH對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effects of pHon the specific enzyme activity

2.2.2 最適p H值的研究 在溫度為75℃,反應(yīng)10 min的條件下,測(cè)定反應(yīng)p H值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0時(shí)的酶活,結(jié)果見圖8。該酶隨著p H的增加,酶活力呈上升趨勢(shì),在p H值為7.5時(shí)酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高,然后隨著p H上升酶活開始下降,且在p H 6.0～9.0相對(duì)酶活達(dá)到80%以上。因此確定其反應(yīng)最適p H為7.5,在p H 6.0～9.0相對(duì)穩(wěn)定。該結(jié)果與菌種的生長(zhǎng)特性密切相關(guān)。理的酶活為100%,由此確定酶的熱穩(wěn)定性。由圖9可知,溫度75℃下處理,酶活基本可以保持100%;經(jīng)80℃處理80 min內(nèi)都可以基本維持90%左右;當(dāng)經(jīng)85℃處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活逐漸緩慢下降但60 min內(nèi)都可以維持80%,在保溫80 min殘余酶活力大約為78%;而經(jīng)90℃處理酶活急劇下降最后在大約57 min后就沒有酶活,而這些充分體現(xiàn)了它在75～85℃范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性,與Stefan Jane ek[14]和Jin-Hee Park[15]的研究結(jié)果基本一致。

圖9 酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Effect of temperature on the enzyme stability

2.2.4 酶的p H穩(wěn)定性研究 如圖10酶的p H穩(wěn)定性,可見穩(wěn)定范圍較寬,在p H 6.0～8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定,殘余酶活力都可以維持在80%左右。

圖10 酶的pH穩(wěn)定性Fig.10 Effect of pHon the enzyme stability

2.2.3 酶的熱穩(wěn)定性研究 在相對(duì)穩(wěn)定的p H值下,分別測(cè)定酶的熱穩(wěn)定性。將酶液與50 mmol/L Tris-HCl(p H 7.5)在75～90℃保溫,分別在5、10、20、40、60、80 min取樣測(cè)定酶活,以未經(jīng)保溫處

3 結(jié) 語

4-α-轉(zhuǎn)糖基酶在重組E.coliDH-5α-TA中成功地被表達(dá)、分離并鑒定。據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道,4-α-轉(zhuǎn)糖基酶具有產(chǎn)大環(huán)糊精的功能[15],該實(shí)驗(yàn)用HPLC法證實(shí)了該酶的轉(zhuǎn)糖基活性,且最小的作用單位是麥芽糖,為該酶的進(jìn)一步轉(zhuǎn)糖基活性研究奠定了基礎(chǔ)。重組E.coliDH-5α-TA菌株所產(chǎn)的4-α-轉(zhuǎn)糖基酶有較好的熱穩(wěn)定性,在70～85℃范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定且最適溫度為75℃,適合高溫生產(chǎn)工藝,為進(jìn)一步的酶的分離純化提供了方便。酶活最佳p H為7.5,在p H在介于6.0到8.5基本穩(wěn)定。酶的相對(duì)分子質(zhì)量(約為57 000)和酶學(xué)性質(zhì)與報(bào)道的芽孢桿菌屬的其他轉(zhuǎn)糖基酶性質(zhì)類似。因此本研究為今后對(duì)該菌的生產(chǎn)化應(yīng)用及大環(huán)糊精的研究提供了可能,但該菌種的產(chǎn)酶率還偏低,有待進(jìn)一步提高。

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(責(zé)任編輯:朱明)

Purification and Properties of 4-α-Glucanotransferase Producing Large-Ring Cyclodextrin

J I Xue-xia1,2, WANGJin-peng1,2, XU Xue-ming1,2, J IN Zheng-yu＊1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

4-α-glucanotransferase has the function of generating large-ring cyclodextrin.The crude enzymes production by the genetic mutant ofE.coli D H-5α-TA(CGMCC No.3093)was separated and purified by high-temperature processing(65℃,20 min),Ni-NTA affinity column and dialysis.The purified enzyme was demonstrated by SDS-PAGE to be a homogeneous protein and the molecular weight was estimated as 57KDa.It was proved to be with the high level of transglycosylation activity by HPLC which was always used to measure the oligosaccharide and its smallest substrate was maltose.The enzyme exhibited high stability at the temperature range from 70℃to 85℃and the p H range from 6.0 to 8.5.The optimal temperature for the enzyme was 75℃and optimal p H was 7.5,respectively.

4-α-glucanotransferase,large-ringcyclodextrin,separationandpurification, enzymatic property

TS 236.9

:A

1673-1689(2010)03-0336-06

2009-07-15

2007國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2007DFA31120);江蘇省自然科學(xué)基金創(chuàng)新學(xué)者攀登項(xiàng)目(BK2008003);食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2008年度目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200804);江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008317)。

＊通信作者:金征宇(1960-),男,江蘇揚(yáng)州人,教授,工學(xué)博士,博士生導(dǎo)師,主要從事碳水化合物研究。Email:jinlab2008@yahoo.com