高血壓腦出血早期血腫周圍腦組織細胞凋亡與凝血酶表達相關(guān)性的研究

彭紹鵬, 任海軍, 高俊瑋, 侯博儒, 張建生, 霍龍偉

高血壓腦出血(hypertensive intracerebral hemorrhage,HICH)是神經(jīng)科常見的急、危、重癥之一,有較高的病死率和致殘率。腦出血后除血腫擴大導(dǎo)致的機械性損傷外,還有腦水腫、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腦血管痙攣等繼發(fā)性損傷[1]。研究表明凝血酶是導(dǎo)致腦出血后繼發(fā)性損傷的重要因素。本實驗在不同時間段檢測高血壓腦出血早期血腫周圍腦組織中細胞凋亡與凝血酶表達的變化,從而觀察 HICH后凋亡變化的時間窗,并探討其與凝血酶表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 實驗組標(biāo)本取自 2008年 6月～2009年 8月因高血壓腦出血在我科住院手術(shù)治療的患者。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前有高血壓病史;(2)經(jīng) CT或 MR掃描證實為自發(fā)腦內(nèi)血腫,血腫量幕上﹥ 30ml,幕下﹥ 10ml;(3)GCS≥5分。排除標(biāo)準(zhǔn):所有患者均排除顱腦損傷、炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病、顱內(nèi)動脈瘤、腦血管畸形、使用抗凝劑致腦出血、混合性卒中或出血性梗死以及合并嚴(yán)重心肝腎功能衰竭、糖尿病或嚴(yán)重肺部感染者。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)共收集病例 36例,其中男 24例,女 12例;年齡 42～73歲,平均 53.4±7.7歲。根據(jù)多田氏公式計算出血量,其中出血量 10～20ml者 2例(均為小腦出血),47～62ml者 13例,63～77ml者 18例,78～92ml者 3例,平均 60.3±8.1ml。其中左側(cè)基底節(jié)區(qū)出血 11例,右側(cè)基底節(jié)區(qū)出血 23例,小腦出血 2例。按發(fā)病至手術(shù)的時間分為 5組:＜6h(7例)、6～ 12h(11例)、12～ 24h(8例)、24～ 48h(6例)、48～72h(4例)。對照組 5例標(biāo)本取自同期在我科住院手術(shù)治療的側(cè)腦室腫瘤的患者,所有患者術(shù)前經(jīng) MR證實。

1.2 標(biāo)本采集方法 實驗組標(biāo)本取自高血壓腦出血血腫周圍的腦組織,血腫位于基底節(jié)區(qū)者經(jīng)骨瓣或小骨窗開顱,經(jīng)側(cè)裂-島葉入路至血腫腔,吸除部分血腫后緊貼血腫周圍用取瘤鉗收取標(biāo)本,直徑約 5mm。對照組標(biāo)本在經(jīng)皮層入路切除腫瘤時于無血管及出血的腦實質(zhì)中取得正常腦組織,直徑同前,注意避免血液污染。以上組織標(biāo)本取出后即浸入 4%的多聚甲醛中固定,12～24h后石臘包埋,常溫干燥存放。所有手術(shù)患者簽訂知情同意書,不違反倫理道德,不影響患者的康復(fù)。

1.3 材料和儀器 TUNEL試劑盒購自南京凱基生物公司。凝血酶兔抗人親和純化抗體及 DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。圖像采集系統(tǒng)為德國 Leica公司生產(chǎn)。

1.4 凝血酶和細胞凋亡測定 將組織蠟塊5μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟、水合后,采用 TUNEL法及免疫組織化學(xué)方法分別檢測血腫周圍腦組織中凋亡細胞及凝血酶表達。具體操作步驟按說明書進行。鏡下 TUNEL陽性細胞胞核或胞漿呈棕黃色,凝血酶陽性細胞鏡下胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。每張切片隨機選擇 5個視野,高倍鏡(400倍)下計數(shù)陽性細胞和陰性細胞,計算陽性率(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))和平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。檢測數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,相關(guān)性檢驗采用 Spearman相關(guān)分析,P﹤ 0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

TUNEL顯示對照組基本無陽性細胞,＜6h組有輕微表達,6h后逐漸增高,12～24h組增高顯著并于24～48h達高峰,48～72h組有所回落,但仍維持較高水平。凝血酶表達變化與此一致。相關(guān)分析顯示:細胞凋亡與凝血酶表達呈顯著正相關(guān)(r=0.7451,P＜0.05或 P＜0.01)(見表1)。

表1 高血壓腦出血后不同時間凋亡和凝血酶表達的變化±s)

表1 高血壓腦出血后不同時間凋亡和凝血酶表達的變化±s)

與對照組相比*P﹤ 0.05,▲P﹤ 0.01;與﹤ 6h組相比△P﹤ 0.01;與 6～12h組相比★P﹤ 0.01;與 12～24h相比◆P﹤ 0.01;與 24～48h組相比◇P﹤ 0.01

例數(shù)Tunel凝血酶578640.32±0.0371.28±0.397.19±2.53*6.13±2.07*1115.11±3.69▲△17.56±4.09▲△28.26 ±7.83▲△★34.55 ±8.25▲△★53.79±6.35▲△★◆55.83±9.50▲△★◆38.23±3.29▲△★◆◇40.42±5.37▲△★◆◇253.692256.006

3 討 論

細胞凋亡(apoptosis)是不同于細胞壞死的一種細胞死亡方式,是機體在生長、發(fā)育和受到外來刺激時清除衰老和受損傷的細胞以保持機體內(nèi)環(huán)境平衡的一種自我調(diào)節(jié)機制,其過程受一系列相關(guān)基因及蛋白酶的調(diào)控。2003年,Qureshi等[2]在腦出血患者手術(shù)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,血腫周圍細胞凋亡的平均比例為 38%。本實驗結(jié)果顯示,HICH后 6h血腫周邊 TUNEL陽性細胞表達開始增加,第 12～24小時明顯增多,24～48h達高峰,隨后逐漸降低。凝血酶表達與此一致,兩者有顯著的相關(guān)性。

凝血酶是由凝血酶原轉(zhuǎn)變而來的多功能絲氨酸蛋白酶,主要參與凝血、抗凝、血栓形成和纖溶的調(diào)節(jié)。生理情況下,凝血酶原主要由肝臟合成,凝血級聯(lián)反應(yīng)激活后產(chǎn)生的 Xa可使凝血酶原裂解形成凝血酶。凝血酶具有雙重細胞效應(yīng)[3],低濃度(＜1μ/ml)有神經(jīng)保護作用,而高濃度的凝血酶作用一定時間后可導(dǎo)致組織損傷及細胞凋亡[4]。Xue等[5]將 25U凝血酶或血漿注入大鼠紋狀體,除了大量炎細胞浸潤及反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增多,還檢測到神經(jīng)細胞凋亡。

腦出血后凝血酶的產(chǎn)生來自 3個方面:(1)腦出血后血腫凝固過程產(chǎn)生的大量凝血酶;(2)血腦屏障破壞后血液中部分凝血酶進入血腫周圍組織;(3)局部腦組織損傷后新的凝血酶原生成[6]。生理情況下每毫升血漿可產(chǎn)生 210～360U的凝血酶,而 1ml血僅需 1U凝血酶即可在 15s內(nèi)凝固。故腦出血時大量富余的凝血酶滲透到組織間隙,直接對神經(jīng)組織造成損傷。李恒等[7]在動物模型中發(fā)現(xiàn),腦出血后 12h凝血酶顯著增加,48h達高峰,本實驗結(jié)果與此基本一致。

有關(guān)凝血酶導(dǎo)致凋亡的機制尚不清楚。楊文瓊等[8]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)凝血酶可能是通過抑制 Bcl-2的表達,增強 Bax的表達,降低 Bcl-2和 Bax的比值,激活 JNK信號傳導(dǎo)通路導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡。關(guān)景霞等[9]發(fā)現(xiàn)凝血酶還可促進凋亡調(diào)控因子Caspase-3的表達。新近發(fā)現(xiàn)凝血酶誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡與干擾細胞周期有關(guān)。Rao等[10]在培養(yǎng)的神經(jīng)元加入凝血酶后發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白 cyclinD1和 cyclinE減少,并發(fā)現(xiàn)凝血酶可誘導(dǎo)周期素依賴性蛋白激酶 4(Cdk4)和促凋亡蛋白 Bim的表達,而 cdk4的抑制劑可阻止 bim的表達和凝血酶誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡。

腦出血后凝血酶表達與神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)性為腦出血后抗凝治療提供了一定的依據(jù)。方琪等[11]報道凝血酶抑制劑水蛭素能減輕凝血酶的致凋亡作用。新型凝血酶抑制劑阿加曲班在 Matsuoka等[12]的臨床實驗中得到了可喜的成果,但其具體實施尚有待發(fā)掘。高血壓腦出血后采取手術(shù)清除血腫還是鉆顱引流不同學(xué)者有不同看法,但腦出血后血凝塊可釋放大量凝血酶并引起繼發(fā)性神經(jīng)損傷,這無疑為腦出血后及時清除血腫提供了一定的理論依據(jù)。

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