S-烯丙基別半胱氨酸對(duì)缺血 /再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

張 峰, 劉國(guó)平, 申 捷, 秦海軍

腦缺血是危害人類的重大疾病之一,在發(fā)達(dá)國(guó)家,致死率第三,致殘率第一[1],我國(guó)致死率上升至第一、二位[2]。目前除溶栓外尚無有效的治療方法。但是由于時(shí)間窗的限制,溶栓僅適用于小部分患者。因此尋找能夠有效緩解腦缺血損傷的藥物非常必要。腦缺血的過程中,凋亡是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié),是遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式。線粒體功能的損傷在凋亡的過程中起著很重要的作用,目前認(rèn)為,腦缺血后,缺氧缺糖,導(dǎo)致線粒體膜通透性的改變,引起大量離子內(nèi)流,導(dǎo)致膜電位的喪失,同時(shí) AIF和 Cytc釋放至細(xì)胞質(zhì)中,引發(fā)凋亡[3]。S-烯丙基別半胱氨酸(SAC)具有抗炎、抗氧化等廣泛藥理作用[4],已有報(bào)道,它有較好的抗腦缺血的作用,具有抗氧化和抗凋亡的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)主要觀察其通過線粒體途徑的抗凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 SAC購自 Sigma公司,TUNNEL試劑盒購自海門碧云天生物試劑公司,AIF、Cytc以及 GAPDH一抗,HRP標(biāo)記二抗均購自Abacm公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 30只雄性 SPF級(jí)別成年 SD大鼠,體重 220～250g,由復(fù)旦醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分成 3組:假手術(shù)組(sham)、缺血 /再灌注組 (I/R)、SAC100組 (100mg/kg,ip)。缺血后 30min給藥。

1.3 模型制備 參照 Longa等的線栓改良法制備大鼠右側(cè)大腦MCAO局灶性腦缺血模型。大鼠用 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中切口,分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈,結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈根部,由頸總動(dòng)脈近分叉處剪一小口插入尼龍線(長(zhǎng) 50mm,直徑0.23mm在 18mm處作標(biāo)記),插入長(zhǎng)度約(18±0.5)mm感到有輕微阻力時(shí)停止,扎緊并固定線栓,縫合皮膚,阻斷血流 2h后,拔掉線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插線栓外,其余步驟同上,再灌注時(shí)間24h后處死,取皮質(zhì)備用。

1.4 梗死體積測(cè)定 大鼠局灶性腦缺血后24h斷頭取腦,將腦置-20℃冰箱內(nèi) 20min,去除嗅球、小腦后,沿冠狀平面每片約 3mm切 8刀片。然后迅速將腦片置于 5ml濃度為 1%的紅四氮唑溶液中,避光 37℃,溫孵 30min,其間每隔 7～8min翻動(dòng) 1次,經(jīng)染色后,正常腦組織呈玫瑰紅色,而梗死組織呈白色,照相用 imagetool3軟件計(jì)算缺血區(qū)體積。

1.5 AIF和 Cytc蛋白表達(dá) 從超低溫冰箱中取出凍存的皮質(zhì),經(jīng) RIPA液勻漿裂解后,12000r/mim離心 20min,棄沉淀,收集上清液用 Bradford法測(cè)定總蛋白含量.加樣蛋白含量 50μg經(jīng) 10%SDSPAGE電泳分離,4℃條件下經(jīng) 3～4h將蛋白電轉(zhuǎn)移PVDF膜,置膜于含 50g/L脫脂奶粉中(TBST緩沖液稀釋)封閉 1h,分別加入特異性兔抗鼠 AIF、Cytc Ab(1∶1000稀釋)、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體(1∶8000稀釋)進(jìn)行免疫反應(yīng),以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色,ECL超敏曝光,以 GAPDH為內(nèi)參。Image-pro5.0軟件分析灰度值。

1.6 線粒體膜電位檢測(cè) rhodamine 123本身具有熒光,進(jìn)入細(xì)胞后,可以選擇性地富集在線粒體上,線粒體內(nèi) rhodamine 123的量隨膜電位的變化而變化。通過測(cè)定線粒體 rhodamine 123熒光強(qiáng)度,反映膜電位及其變化。新鮮制備線粒體,各測(cè)定管先加入膜電位反應(yīng)緩沖液 (蔗糖 15mmol/L,MgCl25mmol/L,琥珀酸鈉 5mmol/L,K2HPO4,Hepes20mmol/L,pH7.4)2.5ml,26μmol/L 40μl,然后加入 20μl線粒體蛋白混懸液,室溫下 10min,激發(fā)波長(zhǎng) 503nm,發(fā)射波長(zhǎng) 527nm,熒光酶標(biāo)儀檢測(cè),記錄數(shù)值,以熒光值的改變代表膜電位的改變。

1.7 TUNEL染色 將大鼠麻醉,開胸經(jīng)升主動(dòng)脈插管,依次灌注生理鹽水和 10g/L的甲醛各200ml,斷頭取腦,取缺血側(cè)前 1/2皮質(zhì)置于同一甲醛溶液中固定 3d,石蠟包埋。面連續(xù)冠狀切片,片厚 4μm。采用碧云天公司凋亡檢測(cè)試劑盒染色。光鏡(400×)下觀察凋亡細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍鏡下)。任意選取 3個(gè)高倍鏡視野,取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 SAC對(duì)梗死體積的影響 模型組梗死體積為 25.33%±2.1%,SAC治療組能夠顯著降低MCAO引起的梗死(16.31%±1.8%,P)＜0.01)(見圖1)。

2.2 SAC對(duì) AIF和 Cytc蛋白表達(dá)的影響 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)均表達(dá)一定量的 AIF(0.32±0.02)、Cytc(0.30±0.01)蛋白,模型組大鼠表達(dá)量較正常組顯著增加(0.51±0.01,P＜0.01;0.54±0.05,p＜0.01),SAC治療組能夠顯著降低 MCAO引起的 AIF和 Cytc表達(dá)增高(0.35±0.03,P＜0.01;0.33±0.04,P＜0.01)(見圖2)。

2.3 SAC對(duì)線粒體膜電位的影響 SAC能夠顯著降低缺血再灌注所引起的 OD值下降,表明SAC能夠提高缺血再灌注引起的線粒體膜電位下降(見圖3)。

2.4 TUNNEL染色 假手術(shù)組僅有少量凋亡陽性細(xì)胞。缺血再灌注組出現(xiàn)極強(qiáng)的凋亡信號(hào)。SAC能夠顯著降低凋亡信號(hào)。隨機(jī)選取 3個(gè)高倍境視野(×200),計(jì)數(shù) TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)求平均值(見圖4)。

圖1 SAC對(duì)腦缺血再灌注引起的梗死體積的影響

圖2 SAC對(duì) AIF和 Cytc蛋白表達(dá)的作用

圖3 SAC對(duì)缺血再灌注后膜電位的影響

圖4 SAC對(duì)腦缺血再灌注引起凋亡的影響

3 討 論

卒中引起的細(xì)胞死亡是由興奮性神經(jīng)毒性、酸中毒、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等復(fù)雜機(jī)制所引起,缺血時(shí),血流完全阻斷的區(qū)域(即梗死中心區(qū)),迅速發(fā)生壞死;而由于周圍血管部分代償,梗死周圍神經(jīng)細(xì)胞主要死亡方式是細(xì)胞凋亡。這一部分也是我們搶救的重點(diǎn)。尋找具有抗凋亡活性的藥物,并且確定其作用機(jī)制也顯得尤為重要。細(xì)胞凋亡激活途徑包括線粒體依賴的和非線粒體依賴的途徑。

線粒體是多種促細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)分子的靶點(diǎn),無論內(nèi)源性途徑還是外源途徑都起著重要的作用[6]。在各種促細(xì)胞凋亡信號(hào)作用下,線粒體膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔不可逆性過渡開放,導(dǎo)致線粒體跨膜電位屏崩解,呼吸鏈解偶聯(lián),線粒體基質(zhì)滲透壓升高,內(nèi)膜腫脹,位于線粒體膜間隙的 Cytc和 AIF及酶原等釋放于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),通過激活下游的 caspase啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[7]。Cytc在細(xì)胞凋亡過程中,從線粒體釋放進(jìn)人胞質(zhì),與胞質(zhì)中凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和 caspase-9相互作用,形成復(fù)合物,最終導(dǎo)致caspase酶活化[8]。AIF從線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)人胞質(zhì)和胞核,直接導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和大片段降解,這些效應(yīng)不依賴于 caspase酶[9]。線粒體通過不斷產(chǎn)生能量維持細(xì)胞存活,而通過釋放多種促凋亡分子啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程,二者既相互聯(lián)系又相互矛盾,成為細(xì)胞死與活的調(diào)控中樞。已有文獻(xiàn)報(bào)道,SAC能夠通過抗氧化作用,和調(diào)節(jié)興奮性氨基酸的表達(dá)保護(hù)缺血性腦損傷[10]。在腫瘤方面,也有報(bào)道其能夠抑制正常細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。本研究表明 SAC能夠通過保護(hù)線粒體,減少 AIF和 Cytc的釋放,從而起到抗凋亡的作用。至于對(duì)線粒體的保護(hù),是直接的作用,還是抗氧化作用的間接途徑,還有待進(jìn)一步研究。

總而言之,100mg/kg SAC缺血后 30min給藥能減少大鼠缺血再灌注后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,這可能是通過減少 Cytc和 AIF蛋白從線粒體的釋放發(fā)揮作用。

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