CpG-ODN加強(qiáng)樹突狀細(xì)胞疫苗治療小鼠膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究

聶志林,梁培禾,霍文謙,張克勤,靳風(fēng)爍

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科,重慶400042)

盡管樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)疫苗在腫瘤治療中顯示出令人憧憬的前景,但真正為臨床所用,還存在構(gòu)建方法和質(zhì)量控制等問題,在DC的分化過程中,其成熟度與功能直接相關(guān)。研究證明,含未甲基化CpG基序的細(xì)菌DNA或人工合成的寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotieds,ODN)具有強(qiáng)大的促DC成熟功能[1-2]。本研究利用CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG-ODN)作為骨髓來源DC的成熟刺激信號,體外誘導(dǎo)DC充分成熟,并將膀胱腫瘤抗原負(fù)載于DC,制備 DC疫苗,探討CpG-ODN對 DC疫苗治療小鼠膀胱腫瘤模型作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動物 BTT739小鼠膀胱腫瘤細(xì)胞株,本室保存,T739近交系小鼠48只,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供,雌雄各半,5周齡,體質(zhì)量20～25 g。

1.2 主要試劑 CpG-ODN:ATA ATC GAC GTT CAA GCA AG[3],上海生工生物技術(shù)公司合成,兩端均用磷硫酰修飾。FITC-大鼠抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC-大鼠抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC標(biāo)記的同型IgG購自美國Promega。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 BT T 739小鼠膀胱腫瘤細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞生長至80%～90%時(shí),臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞,檢測活細(xì)胞比例大于95%,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL。將細(xì)胞懸液注射于T739小鼠右前腋皮下,每只0.2 mL(2×105個(gè))。

1.4 負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗的制備 參照文獻(xiàn)[4-5],制備BTT739腫瘤細(xì)胞凍融粗提全抗原,體外沖擊致敏法:收獲培養(yǎng)第7天的DC[2],調(diào)整濃度為1×106/mL,常規(guī)臺朌藍(lán)試驗(yàn)示活細(xì)胞數(shù)大于90%;每孔按DC與抗原細(xì)胞的比例1∶10(抗原的量以凍融前腫瘤細(xì)胞的量計(jì))加入BTT739腫瘤細(xì)胞凍融抗原。加入 rmGM-CSF、rmIL-4使其終濃度分別為500 u/mL、200 u/mL,繼續(xù)置于37℃,5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)48 h,加入CpG-ODN使其終濃度分別為2 μ mol/L,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲DC細(xì)胞即得DC疫苗。

表1 不同治療組荷瘤小鼠皮下腫瘤體積變化情況(cm3)

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 T739小鼠48只,接種腫瘤細(xì)胞 7 d后,隨機(jī)分為4個(gè)組,12只/組。分別為:(1)磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(A組);(2)DC疫苗組(B組);(3)CpG-ODN組(C組);(4)DC+CpG-ODN聯(lián)合治療組(D組)。每組又隨機(jī)分2個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只。亞組1:用于觀察腫瘤生長及荷瘤小鼠存活情況?？ǔ邷y定腫瘤的長徑a和短徑b,按v=1/2ab2算出體積。2次/周,繪制腫瘤體積變化曲線,繼續(xù)觀察小鼠死亡情況,直至其中1組小鼠死亡達(dá)到50%時(shí)停止體積測量。亞組2:用于測量瘤重、體積:接種腫瘤細(xì)胞第21天頸椎脫臼法處死全部亞組6只小鼠,稱取瘤重,按上法計(jì)算腫瘤體積,根據(jù)公式計(jì)算瘤重和體積抑制率,移植瘤瘤重抑制率(%)=(空白對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100%,移植瘤體積抑制率(%)=(空白對照組平均體積-治療組平均體積)/空白對照組平均體積×100%。腫瘤組織用于檢測浸潤性樹突狀細(xì)胞(tumor infiltrating dendritic cell,TIDC)表面CD80、CD86 表達(dá)。

1.6 治療時(shí)相點(diǎn)設(shè)置及治療方案 調(diào)整DC疫苗細(xì)胞濃度至1×106/mL,各組實(shí)驗(yàn)動物分別于接種腫瘤細(xì)胞后第7、14天給予相應(yīng)治療,PBS對照組注射PBS 0.2 mL,DC疫苗組注射DC疫苗0.1 mL+PBS 1 mL,CpG-ODN治療組注射濃度為500 μ g/mL的CpG-ODN溶液 0.2 mL,DC疫苗+CpG-ODN治療組注射DC疫苗0.1 mL+CpG-ODN溶液0.1 mL,治療方法采用腫瘤周圍多點(diǎn)注射。

1.7 腫瘤組織TIDC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)提取腫瘤組織浸潤淋巴細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度到5×105/mL,分別加入熒光FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD80單克隆抗體、CD86單克隆抗體,FITC標(biāo)記的同型IgG作為相應(yīng)的陰性對照,行流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行,各組數(shù)據(jù)以s表示,各組間比較采用非配對t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 荷瘤鼠腫瘤生長的一般情況 接種腫瘤細(xì)胞后第7天,小鼠腫瘤平均直徑可達(dá)0.5～1.0 cm,此時(shí)給予第1次治療。接種瘤細(xì)胞后第14天(即第1次治療7 d后)D組平均體積明顯小于A(P＜0.01)、B和C(P＜0.05)組,此時(shí)各組小鼠給予第2次相應(yīng)治療。于接種腫瘤細(xì)胞第17天時(shí),B、C組腫瘤體積也明顯小于A組(P＜0.01,P＜0.05),但B、C組之間腫瘤體積無明顯差異,D組平均體積小于A、B、C組(P＜0.01)(表1)。于接種瘤細(xì)胞后第 22、26、29天,PBS組各有1只小鼠死亡(腫瘤直徑均大于3 cm),終止體積測量觀察,此時(shí)其他 3個(gè)組小鼠也相繼出現(xiàn)死亡。

2.2 DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠的抑瘤效應(yīng)

各治療組亞組2荷瘤小鼠,于接種腫瘤第21天解剖,聯(lián)合治療組平均瘤重及平均體積均顯著小于其它各組(P＜0.01)。DC疫苗組及CpG-ODN組平均瘤重及平均體積均顯著小于PBS對照組(P＜0.01),見表 2。

表2 BTT739荷瘤小鼠不同治療組的抑瘤效應(yīng)

2.3 DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠的存活延長效應(yīng) DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN治療組的荷瘤生存期長于DC組、CpG-ODN組及PBS對照組,DC組、CpG-ODN組荷瘤小鼠生存期長于PBS對照組(P＜0.05),見封2圖1。

2.4 腫瘤組織TIDC表面分子CD80及CD86的表達(dá) DC+CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)水平高于DC組及PBS對照組(P＜0.01),雖略高于CpGODN組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86表達(dá)水平高于DC組及PBS對照組(P＜0.05),在DC組中二者表達(dá)雖略高于PBS對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表3。

表3 小鼠腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86的表達(dá)(%,

表3 小鼠腫瘤組織中TIDC表面CD80、CD86的表達(dá)(%,

a:與A、B組比較,P＜0.01;b:與A組比較,P＜0.01;c:與D組比較,P＜0.05。

組別 CD80 CD86 A 組 11.32±1.18 12.65±1.22 B組 13.02±2.64 14.63±3.08 C組 17.75±3.13a 18.72±2.79bc D組 19.82±3.36a 21.85±4.31a

3 討 論

腫瘤細(xì)胞可通過下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原、低表達(dá)或不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子和共刺激分子,使抗原不能被有效遞呈給T細(xì)胞以產(chǎn)生特異性的抗瘤效應(yīng),因此激發(fā)有效的T細(xì)胞介導(dǎo)的抗瘤免疫反應(yīng)是提高腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。單純的抗原不能活化T淋巴細(xì)胞,必須經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞(APC)遞呈,因?yàn)門淋巴細(xì)胞活化需要抗原和輔助分子雙信號才能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CT L)形成,發(fā)揮抗瘤效應(yīng)。負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗由于可通過DC表面M HC類分子、共刺激分子將各種已知或未知的腫瘤相關(guān)抗原信息得到有效遞呈,因此作為理想的腫瘤疫苗在實(shí)驗(yàn)和臨床研究受到廣泛重視。

CpG基序(CpG motifs)是一個(gè)含胞嘧啶(cytosine,C)和鳥嘌呤核苷酸(guanine,G)的二核苷酸。人工合成的CpG-ODN作為一種新型免疫佐劑,多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)研究表明單獨(dú)應(yīng)用可有效治療腫瘤[6-7]。CpG-ODN通過誘導(dǎo)DC的成熟和遷移,從而增強(qiáng)對抗原反應(yīng)性T細(xì)胞刺激能力而間接發(fā)揮作用。腫瘤局部注射CpG-ODN后可活化APC,促進(jìn)其成熟并遷移至局部淋巴結(jié)激活腫瘤特異性T細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞活化后從淋巴結(jié)到達(dá)腫瘤部位而發(fā)揮效應(yīng)。目前CpG-ODN聯(lián)合抗體、細(xì)胞因子治療腫瘤的研究已逐漸開展,體外實(shí)驗(yàn)已顯示出了良好效果,但CpG-ODN能否增強(qiáng)DC疫苗的抗腫瘤效應(yīng),其機(jī)制如何等問題研究的甚少,為此本研究觀察了CpG-ODN對DC疫苗治療小鼠膀胱腫瘤作用的影響。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,21 d時(shí)DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN治療組的荷瘤鼠平均瘤重和平均體積均顯著低于DC疫苗組、CpG-ODN組、PBS對照組,而荷瘤生存期顯著長于其它各組,結(jié)果說明DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤鼠具有較強(qiáng)的抑瘤效應(yīng)和延長生存期作用,而且這種作用強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用CpG-ODN、DC疫苗治療,顯示了CpG-ODN增強(qiáng) DC疫苗抗腫瘤效應(yīng)。DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN治療組及CpG-ODN組腫瘤組織中TIDC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)明顯高于PBS對照組及DC疫苗組,CD80、CD86為成熟DC表面特異性標(biāo)志,這些表面分子的參與是DC完成其抗原遞呈功能所必須,表明CpG-ODN腫瘤周圍注射后可增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中DC的成熟和活化,從而發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng),與 Heckelsmiller等[8]報(bào)道的結(jié)果相似。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),CpG-ODN可增強(qiáng)負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗的免疫治療作用,提示其激發(fā)了機(jī)體強(qiáng)而有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2],本研究認(rèn)為其作用機(jī)制可能與以下幾個(gè)方面有關(guān):(1)CpG-ODN具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)DC成熟、促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化的作用,成熟的DC具有強(qiáng)大的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力;(2)DC高表達(dá)M HC-Ⅰ、Ⅱ類分子和CD80/CD86等共刺激分子,為T淋巴細(xì)胞充分活化提供信號刺激;(3)CpG-ODN可增強(qiáng)DC疫苗誘導(dǎo)的CT L免疫殺傷活性,提高細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)分泌,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞增殖。CpG-ODN可維持長期的腫瘤特異性免疫反應(yīng),有研究表明CpG-ODN可以抑制DC的凋亡,延長DC的生存期[9],這對于逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致的DC數(shù)量減少、功能受抑制具有重要意義,同時(shí)腫瘤局部CpG-ODN可引起T淋巴細(xì)胞向腫瘤部位浸潤,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞毒性反應(yīng)的啟動。CpG-ODN無免疫原性,不會導(dǎo)致自身免疫反應(yīng),因此是一種理想的DC激活劑,可望應(yīng)用于體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)。

[1] Pilon TS,Li W,Briggs JJ,et al.Immunostimulatory effects of CpG-ODN upon dendritic cell-based immunotherapy in a murine melanoma model[J].J Immunother,2006,29(4):381.

[2] 聶志林,靳風(fēng)爍,梁培禾,等.CpG-ODN促進(jìn)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞成熟作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(2):136.

[3] Actins H,Davis BR,Kirby JA,et al.Polarisation of a T-helper cell immune response by activation of dendritic cells with CpG-containing oligonucleotides:a potentiao therapeutic regime:for bladder cancer immunotherapy[J].Br J Cancer,2003,89(12):2312.

[4] 高維實(shí),閔軍,褚忠華,等.肝癌細(xì)胞凍融抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備與活化[J].中國病理生理雜志,2003,19(9):1279.

[5] Silke G,Michael S,Herbert R.Dendritic cells pulsed with tumor-derived lysate augment T cell mediated tumor cell lysis[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2004,131(2):176.

[6] Baines J,Celis E.Immune-mediated tumor regression induced by CpG-containing oligodeoxynucleotides[J].Clin Cancer Res,2003,9(7):2693.

[7] Heckelsmiller K,Rall K,Beck S,et al.Peritumoral CpG DNA elicits a coordinated response of CD8 T cells and innate effectors to cure established tumorsin a murine colon carcinoma model[J].J Immunol,2002,169(7):3892.

[8] Heckelsmiller K,Beck S,Rall K,et al.Combined dendritic cell-and CpG oligonucleotide-based immune therapy cures large murine tumors that resist chemotherapy[J].Eur J Immunol,2002,32:3235.

[9] 杜宇琛,林蘋,張潔,等.CpG-ODN加強(qiáng)樹突狀細(xì)胞疫苗抗Lewis肺癌的研究[J].中華腫瘤雜志,2005,27(1):1.