寧夏漢族人126名甘露糖結(jié)合凝集素基因多態(tài)性分析*

馬力通 ,李 珺,王玉炯

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所,包頭 014010;2.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin,MBL)是參加天然免疫的宿主防御分子,它能夠通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)和吞噬作用從而在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用[1]。迄今為止,所發(fā)現(xiàn)的MBL基因結(jié)構(gòu)區(qū)突變均為第1外顯子的點(diǎn)突變,分別是密碼子 54(GGC→GAC,Gly→Asp)、57(GGA→GAA,Gly→Glu)以及密碼子 52(CGT→TGT,Arg→Cys)(簡(jiǎn)稱(chēng)為MBL-54、MBL-57和MBL-52,相應(yīng)突變的等位基因命名為B、C、D,野生型為 A),這些基因的突變干擾了M BL形成穩(wěn)定的功能性的多聚體,使血清中MBL水平下降,從而導(dǎo)致了調(diào)理缺陷,這與臨床反復(fù)感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、艾滋病以及乙型肝炎等多種疾病的發(fā)生相關(guān)。在MBL研究的基礎(chǔ)上,臨床治療中研究者成功嘗試輸入天然血漿MBL或輸入重組M BL來(lái)改善由MBL缺失引起的慢性疾病的狀況[2]。MBL基因點(diǎn)突變存在種族差異。目前,尚無(wú)寧夏漢族人群MBL基因突變類(lèi)型及其頻率研究的報(bào)道。為此研究中國(guó)寧夏漢族人群的MBL基因突變,為進(jìn)一步了解MBL基因突變與疾病的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 126名無(wú)血緣關(guān)系的健康個(gè)體均來(lái)自于寧夏地區(qū),其中男84名,女42名,年齡 6～69歲,其父母均為寧夏漢族。在知情同意的原則下,抽取研究個(gè)體的外周靜脈血待用。

1.2 MBL基因的擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[3]提取外周血基因組DNA,以所提取基因組DNA作為模板擴(kuò)增MBL基因外顯子1,參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物,引物由華美生物公司合成。引物序列為(1)M BL54和 MBL57的 PCR引物序列,Forward:5′-AGT CGA CCC AGA TTG TAG GAC AGA G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′。(2)MBL52的 PCR引物序列,Forward:5′-CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA AGA CGC G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GT T TCC TCT GGA AGG-3′。PCR反應(yīng)體系為20μ L:基因組 DNA 1.5 μ L,10 ×PCR Buffer 2 μ L,2 μ M 引物各 2 μ L,2.5 mM dNTPs 1.6 μ L,5 u/mL Taq DNA 聚合 酶 0.2 μ L,10.7 μ L ddH2O。PCR反應(yīng)條件為(1)MBL54和 MBL57的反應(yīng)條件:94℃4 min;94℃30 s,58℃40 s,72℃60 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃5 min。(2)MBL52的反應(yīng)條件:在密碼子52位處利用SDM-PCR引入一個(gè)新的酶切位點(diǎn) MluⅠ,其PCR反應(yīng)條件為94℃4 min;94℃40 s,65℃40 s,72℃60 s,28個(gè)循環(huán);最后72℃5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 限制性?xún)?nèi)切酶酶切 酶切反應(yīng)體系15 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1.5 μ L,Buffer 2 μ L,BSA 0.2 μ L,限 制性?xún)?nèi)切酶 0.2 μ L,ddH2O 11.1 μ L。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別被 BanⅠ 、MboⅡ 、M luⅠ于50℃、37℃、37℃酶切4～5 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電泳結(jié)束后常規(guī)銀染,凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)算出寧夏漢族MBL基因的各種基因型頻率和等位基因頻率,使用SPSS12.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,利用χ2檢驗(yàn)分析MBL基因多態(tài)性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及各組間差異,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MBL基因多態(tài)性PCR-RFLP結(jié)果 見(jiàn)圖1。

圖1 MBL基因多態(tài)性PCR-RFLP結(jié)果

2.2 寧夏漢族MBL基因多態(tài)性分布情況 在寧夏漢族只檢測(cè)出兩種等位基因野生型A和變異型B(54位密碼子由GGC→GAC)未檢出變異型C、D等位基因。126名共檢出野生型AA為90名,突變雜合型AB為35名,突變純合型BB為1名;基因型頻率分別為0.714 3,0.277 8,0.007 9;A,B基因頻率分別為0.853 2,0.146 8。經(jīng)χ2檢驗(yàn),符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說(shuō)明本研究人群具有群體代表性。

2.3 與其他漢族人群M BL基因多態(tài)性分布的比較 寧夏漢族與廣東漢族[5]均只檢出 A、B兩種等位基因,經(jīng)χ2檢驗(yàn),寧夏漢族與廣東漢族[5]之間MBL基因多態(tài)性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,表1)。并且前者B的等位基因頻率明顯高于后者。

表1 寧夏、廣東兩地漢族MBL基因多態(tài)性分布情況

3 討 論

MBL是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有防御功能的C型凝集素。編碼MBL的基因含有4個(gè)外顯子,分別編碼N-端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸區(qū)和糖識(shí)別區(qū)。其中外顯子1編碼N-端富含半胱氨酸區(qū)和部分膠原區(qū)。MBL結(jié)構(gòu)基因外顯子1第52、54、57位的突變使其產(chǎn)物不能形成穩(wěn)定的功能性的多聚體結(jié)構(gòu),從而造成MBL不能發(fā)揮調(diào)理作用和激活補(bǔ)體凝集素途徑的作用。

人群中MBL的基因突變率很高,并且MBL結(jié)構(gòu)基因各點(diǎn)突變的基因頻率與種族有關(guān)。南部非洲人以57位密碼突變多見(jiàn)。MBL-54突變主要發(fā)生在歐洲、亞洲人群中,而在黑人中MBL-54突變極罕見(jiàn)。MBL-52突變少見(jiàn)且種族差別不明顯。國(guó)外近年來(lái)已在幾個(gè)種族人群中研究MBL基因多態(tài)性與感染性疾病、自身免疫性疾病的相關(guān)性[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)漢、維、蒙、藏、彝族的研究中未發(fā)現(xiàn)MBL-52、MBL-57的基因突變,但是MBL-54的基因突變卻很常見(jiàn)[7]。本文所取樣本為一般人群,除了要求為漢族外,未作任何限制,故可以代表寧夏地區(qū)的漢族人群。

本實(shí)驗(yàn)確定了寧夏漢族人群MBL基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的分布情況,研究結(jié)果顯示,寧夏漢族人群與文獻(xiàn)[5]中的廣東地區(qū)漢族相比較,M BL基因多態(tài)性分布差異顯著,并且寧夏漢族人群B的等位基因頻率明顯高于后者。漢族是中華民族的主要成員。漢族的形成和發(fā)展,經(jīng)歷了一個(gè)十分復(fù)雜的融合、遷移的歷史過(guò)程,是歷史上融合了許多古代的非漢族人群而形成的。杜若甫和肖春杰[8-9]認(rèn)為以長(zhǎng)江為界,中國(guó)漢族人群分南、北兩大類(lèi)型。各地漢族與當(dāng)?shù)氐纳贁?shù)民族在遺傳結(jié)構(gòu)上十分相近,而南、北方漢族的遺傳結(jié)構(gòu)卻相差甚遠(yuǎn),接近于南、北方少數(shù)民族間的平均差異。寧夏漢族MBL基因多態(tài)性分布與廣東漢族[5]相比有明顯差異,證實(shí)了同一人種內(nèi)部MBL各等位基因分布存在地理差異也進(jìn)一步支持中國(guó)漢族人群可分為南北兩類(lèi)的假設(shè)。同時(shí)本研究對(duì)寧夏漢族MBL基因多態(tài)性獲得的數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究MBL基因突變與疾病間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。

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