細胞規(guī)?；a(chǎn)過程中的質(zhì)量控制

趙 蕾 管 宇 梅建國 唐 娜 李坤林

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256606）

細胞規(guī)?；a(chǎn)過程中的質(zhì)量控制

趙 蕾 管 宇 梅建國 唐 娜 李坤林

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256606）

細胞大規(guī)模培養(yǎng)在生物制藥和疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域是一項基礎(chǔ)工作，是整個生產(chǎn)工藝過程中的中心環(huán)節(jié)，具有十分重要的地位。細胞培養(yǎng)基質(zhì)的優(yōu)劣直接決定終端產(chǎn)品的質(zhì)量與療效，因此嚴格做好細胞培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制顯得尤為重要。筆者從事細胞培養(yǎng)及規(guī)?；a(chǎn)多年，對細胞培養(yǎng)和規(guī)?；a(chǎn)過程中的技術(shù)環(huán)節(jié)有著較為深刻的體會。現(xiàn)就這些相關(guān)問題和注意事項進行簡述和探討。

1 規(guī)?；毎囵B(yǎng)明確對工作者的基本要求

細胞規(guī)?；囵B(yǎng)不能完全等同于細胞生物學(xué)實驗室工作，生產(chǎn)者首先應(yīng)具備的基本素質(zhì)：（1）除掌握操作技術(shù)之外，尚需明白各種操作的基本原理。（2）須具備判定細胞生長好壞和是否發(fā)生污染的能力：對細胞生長的好壞要根據(jù)理論知識和自己的經(jīng)驗來判定其生長的穩(wěn)定性，并且根據(jù)判定結(jié)果來進行適當(dāng)?shù)膽?yīng)用；如果懷疑細胞被污染還要能夠?qū)ξ廴厩闆r做出預(yù)判。（3）熟悉體外培養(yǎng)細胞的生存條件、細胞的生物學(xué)性狀及與此有關(guān)的基本理論知識。（4）應(yīng)該具有較高的無菌意識：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品、已消毒與未消毒品、清潔區(qū)與污染區(qū)的材料應(yīng)嚴格分開存放或單獨處理，避免溢出、濺出和產(chǎn)生氣溶膠，吸入或吸出液體時避免傾倒或觸碰細胞培養(yǎng)瓶瓶口。

2 確保細胞培養(yǎng)原料的質(zhì)量可靠

2.1 培養(yǎng)基 規(guī)?；毎囵B(yǎng)對培養(yǎng)基的一致性要求非常高，一年之內(nèi)所用培養(yǎng)基的批號不宜超過2個。

2.2 血清 觀察血清融化后的顏色和清亮度，顏色偏紅或色淺、有大量沉淀者不能使用；血清凍融后的最上層無色透明，活力最差，使用前應(yīng)該搖勻；長時間凍存的血清融化后出現(xiàn)的沉淀物可能會抑制細胞生長，應(yīng)棄去沉淀物；避免反復(fù)凍融；生產(chǎn)中盡量使用同一批號血清。血清溶化后應(yīng)盡快用完，4℃保存期最好控制在2周之內(nèi)。根據(jù)實際情況，血清的滅活步驟可以省略。

2.3 胰酶 （1）胰酶極易潮解，需儲存在冷暗干燥處；（2）需要低溫配制；（3）胰酶分散細胞的活性與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣，所以應(yīng)當(dāng)具體情況具體對待；（4）Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強，要選擇最佳環(huán)境進行胰酶的應(yīng)用；（5）胰酶消化過度造成細胞損傷，所以應(yīng)該控制好胰酶對細胞的消化時間。大規(guī)模快速操作過程中，由于血清中和作用，胰酶不必棄之干凈，但是某些病毒如豬乙腦病毒對胰酶敏感，應(yīng)注意胰酶的殘留量，以免影響病毒增殖滴度。

2.4 水 培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細胞死亡，所以細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)，金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水，常用玻璃或石英蒸餾器制備的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水，超純水的電導(dǎo)率應(yīng)達到18.2M?，最好用龍頭瓶貯存，存放時間一般不應(yīng)超過2周。

2.5 試劑 應(yīng)選用分析純，一旦完成供應(yīng)商評估做好選擇后，不宜輕易更換供應(yīng)商，還要做到保質(zhì)期內(nèi)同一批號，以保證其質(zhì)量穩(wěn)定。

3 保持工作環(huán)節(jié)操作上的一致性

為避免造成人為的差異，應(yīng)將所有操作程序如洗刷、消毒、配液等，制定出統(tǒng)一的規(guī)范和要求，并在一定時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定。

3.1 洗刷與消毒 （1）培養(yǎng)瓶的清洗與消毒。浸泡：新細胞培養(yǎng)瓶使用前應(yīng)先經(jīng)自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸溶液(5%)浸泡過夜；培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)瓶清除培養(yǎng)基后應(yīng)立即浸入自來水中，注意讓水能完全進入瓶皿中，不應(yīng)有氣泡。刷洗：浸泡后的細胞培養(yǎng)瓶要用毛刷沾洗滌劑洗滌，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)；洗刷時應(yīng)特別注意洗刷瓶角部位；已掉毛的毛刷不可使用，以免裸露的鐵絲摩擦內(nèi)壁而出現(xiàn)玻璃劃痕。浸酸：刷洗不掉的極微量雜質(zhì)經(jīng)過硫酸和重鉻酸清潔液浸泡劑的強氧化作用，可被除掉，清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，浸泡時，器皿要充滿清潔液，勿留氣泡，浸泡時間應(yīng)達6h以上。沖洗：刷洗和浸酸后都必須用自來水充分沖洗，每瓶都得用水灌滿，倒掉，重復(fù)五次，然后用純化水重復(fù)沖洗3次。漂洗：先用蒸餾水充分沖洗，使之不留任何殘跡，每瓶都得用蒸餾水灌滿，倒掉，重復(fù)3次以上，再用超純水漂洗3次，晾干備用。包裝：包裝要及時，防止落入灰塵引起二次污染。滅菌：按規(guī)程操作，180℃干烤2～3h。（2）膠塞的清洗與消毒。新購置的橡膠塞在2%的NaOH溶液內(nèi)煮沸15min，用飲用水沖洗后再用4%的鹽酸溶液煮沸15min；用過的膠塞，先經(jīng)渡槽內(nèi)的消毒液浸泡消毒后，隨后以1%洗液煮沸30min，再用刷子刷凈。用飲用水和純化水分別沖洗3～5遍后再浸泡在純化水中24h以上。精洗滅菌：撈出后，用超純水沖洗2～3遍后，晾干包裝，121℃濕熱滅菌40min。

3.2 配液 （1）各種培養(yǎng)用液(培養(yǎng)液、胰蛋白酶、Hanks 液、NaHCO3、抗菌素液)均應(yīng)由專人負責(zé)配制，制備濃度精確、滅菌可靠；所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標(biāo)簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期，并保證做到嚴格按規(guī)程進行操作。（2）培養(yǎng)基的配制注意事項：配制用水及調(diào)pH試劑用水均需新近制備；配制用器皿均需清洗烤干；采用15～30℃的水配制，充分溶解每一種成份，在配制過程中不需加熱助溶；控制調(diào)節(jié)pH用酸、堿加入量，保證培養(yǎng)基滲透壓；過濾完以后要進行無菌檢驗；在使用過程中要注意保存期限。

4 保證細胞培養(yǎng)條件和環(huán)境的穩(wěn)定

4.1 溫度 35～37℃，特別是注意不要高于這個范圍的最高值，要對培養(yǎng)溫度進行定期的驗證。

4.2 氣體 95%空氣/5%CO2。

4.3 酸堿度 pH7.2～7.6(酚紅指示)，注意培養(yǎng)基經(jīng)過過濾后，pH會有所升高，所以過濾后要進行pH的監(jiān)測。

4.4 滲透壓 血漿滲透壓一般為290 Osm/kg，并且不可超出280～320 Osm/kg的范圍。

5 嚴格控制可能對細胞培養(yǎng)帶來的污染

細胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物，分為物理污染、化學(xué)污染和生物污染(細菌、霉菌、病毒、支原體污染)，細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。

5.1 物理因素對細胞產(chǎn)生的影響和應(yīng)對措施 細胞和細胞培養(yǎng)液等培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射(紫外線或熒光)或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。所以使用前應(yīng)將培養(yǎng)液恢復(fù)至室溫，培養(yǎng)用試劑應(yīng)盡量避免存放于光照之下，保持細胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度穩(wěn)定。

5.2 化學(xué)性污染和應(yīng)對措施 （1）血清：選用同一批次的血清，減少成份差異，新購血清使用之前要進行預(yù)試驗。（2）培養(yǎng)液及試劑：選擇高純度的試劑；正確的使用濃度、正確儲存；在保質(zhì)期內(nèi)使用；避免高壓蒸汽滅菌試劑中的化學(xué)物質(zhì)殘留。（3）水：使用新鮮超純水。（4）培養(yǎng)用器皿：避免生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留、消毒劑和清洗劑的殘留、包裝紙殘留和操作時烤焦的瓶塞。（5）培養(yǎng)箱：避免CO2混有有毒氣體及消毒劑和清洗劑的殘留。

5.3 生物污染和應(yīng)對措施

（1）容易發(fā)現(xiàn)的生物污染包括細菌、霉菌和酵母菌。細菌污染：污染迅速、黑色細沙狀，可有不同的外形，培養(yǎng)液渾濁變黃，對細胞生長影響明顯，有抗生素存在時可長期帶菌。霉菌污染：培養(yǎng)液清亮；培養(yǎng)2～3d出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但長時間則細胞的活力狀態(tài)變差。酵母菌污染：培養(yǎng)液清亮，培養(yǎng)瓶底部出現(xiàn)較大顆粒，單個或聚集成團，細胞仍可生長，但長時間則細胞的活力狀態(tài)變差。三種污染均來源于滅菌不徹底的培養(yǎng)器皿，污染的試劑與器材，空氣中常見菌，工作環(huán)境潮濕；人體帶菌。預(yù)防措施：要避免產(chǎn)生著三種污染均需要徹底滅菌，在有效期內(nèi)使用；試劑用前檢菌；環(huán)境及設(shè)施消毒；正確的無菌操作方法。

（2）不容易被發(fā)現(xiàn)的生物污染：包括支原體污染、病毒污染和細胞污染。支原體污染：污染嚴重，難發(fā)現(xiàn)。顯微鏡下看不到，不引起培養(yǎng)液渾濁和pH改變，營養(yǎng)要求高，不容易用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢測到，難去除，不能通過過濾清除大多數(shù)抗生素對其無效。病毒污染：難發(fā)現(xiàn)，隱性感染，無病變，如1型圓環(huán)病毒感染，難清除，無法藥物控制，一旦污染只能廢棄，嚴格的宿主性，自限性，對操作人員存在潛在危險。細胞污染：難于發(fā)現(xiàn)，若出現(xiàn)傳代細胞的生長速度異常，考慮交叉污染。來源：支原體污染—被污染的種子批，人體組織及體液支原體，飛沫傳播，牛血清中的支原體。病毒污染—病毒生產(chǎn)過程中漏毒，細胞株帶毒，血清及其他動物源性試劑，人體帶毒。細胞污染—細胞系交叉污染。預(yù)防措施：支原體污染：保證細胞及血清的來源，確?；|(zhì)和器材無菌，細胞培養(yǎng)時避免交談，操作結(jié)束時消毒臺面，定期檢驗，定期更換細胞，做好詳細的細胞記錄。病毒污染：要進行種子批的外源病毒檢驗和原輔料檢驗；建立良好的生產(chǎn)規(guī)章制度。細胞污染：同一時間只傳同一種細胞，每種細胞要有單獨的培養(yǎng)液及胰酶，建立細胞庫和種子批，定期更換細胞。

體外培養(yǎng)細胞是個系統(tǒng)的工程，在培養(yǎng)過程特別是規(guī)?；a(chǎn)過程中的很多因素都有可能造成生產(chǎn)的失敗，所以還需要做好詳細的培養(yǎng)計劃，把培養(yǎng)過程中的每個環(huán)節(jié)細化，把可能造成污染的因素提前排除或預(yù)防，各項操作要嚴格執(zhí)行標(biāo)準操作規(guī)程和各項規(guī)章制度，這樣才能保證生產(chǎn)出高質(zhì)量的產(chǎn)品。

Q813.1+1

A

1007-1733(2010)06-0078-03

2010–03–14）