電化學(xué)酶免疫傳感器在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展

丁建英，沈 唐，顧春海

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇常熟215500）

電化學(xué)酶免疫傳感器在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展

丁建英，沈 唐，顧春海

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇常熟215500）

電化學(xué)酶免疫傳感器是一種標(biāo)記型的免疫傳感器，它結(jié)合了酶的放大作用和免疫傳感器的靈敏度及特異性，是近幾年來(lái)研究最多、發(fā)展最快，應(yīng)用最廣的一種免疫傳感器。本文綜述了電化學(xué)酶免疫傳感器的特點(diǎn)及其在食品安全領(lǐng)域（包括食源性致病菌、生物毒素、藥物殘留等）的研究應(yīng)用進(jìn)展，并且對(duì)酶免疫傳感器的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

酶免疫傳感器，食品安全，檢測(cè)

Abstract：Electrochemical enzyme-linked immunosensor（ EEIS）is a marker of immune-type sensor，It is a combination of enzyme amplification and the sensitivity and specificity of the immunesensors.It is the most fully studied in recent years，the fastest growing，most widely used immunesensor.This paper reviewed the characteristics of the EEIS and its research and application progress in the field of food safety（including food-borne pathogens，biological toxins，drug residues，etc.），and looked forward to the future development of enzyme EEIS.

Key words：immunosensor；food safety；detection

近年來(lái)由于食品安全問(wèn)題層出不窮，食品安全的快速檢測(cè)方法的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)［1］。電化學(xué)酶免疫傳感器是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，它是將酶電極［2］的化學(xué)放大作用與免疫傳感器的特異性、靈敏性相結(jié)合，檢測(cè)研究效果優(yōu)于普通的免疫傳感器。電化學(xué)酶免疫傳感器具有檢測(cè)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、使用方便、構(gòu)制酶電極方法靈活、體系容易集成化、微型化等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理。電化學(xué)酶免疫傳感器在生物醫(yī)學(xué)研究［3］、環(huán)境監(jiān)測(cè)［4］等領(lǐng)域有了較多的研究應(yīng)用，同樣在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域也有了較多的應(yīng)用研究。本文就酶免疫傳感器在食源性病源菌、生物毒素、藥物殘留等方面的研究應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 電化學(xué)酶免疫傳感器概述

1.1 電化學(xué)酶免疫傳感器的概念

1990年Henry等提出了免疫傳感器的概念［5］。免疫傳感器以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，根據(jù)免疫反應(yīng)中是否使用標(biāo)記物又可分為非標(biāo)記型免疫傳感器和標(biāo)記型免疫傳感器。電化學(xué)酶免疫傳感器是將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種融合性技術(shù)。它結(jié)合了酶催化放大作用、抗原抗體的特異性識(shí)別作用和傳感器測(cè)定的高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)［6］。

1.2 電化學(xué)酶免疫傳感器的原理

酶免疫傳感器的基本原理是通過(guò)酶的催化放大作用和免疫分析的高特異性，將酶與抗體或抗原結(jié)合起來(lái)，形成酶標(biāo)記物，這些酶標(biāo)記物仍保持其免疫活性，然后它與相應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的或含酶的免疫復(fù)合物。再利用結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶對(duì)相應(yīng)的底物催化作用，使底物發(fā)生水解、氧化或還原反應(yīng)，或形成共價(jià)鍵結(jié)合點(diǎn)，通過(guò)電化學(xué)分析方法進(jìn)行定性、定量測(cè)定。常用的電化學(xué)酶免疫傳感器有以下幾種類型：電導(dǎo)測(cè)量式、電位測(cè)量式、電流式、壓電式電容式，其中較常用的是電流式酶免疫傳感器。

1.3 電化學(xué)酶免疫傳感器的特點(diǎn)

目前，食品檢測(cè)的尖端儀器主要是HPLC、AAS、GC-MS、MS-MS、GLC、GC/MS/MS 等，而這些儀器普遍暴露出成本昂貴、操作復(fù)雜和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。與上述儀器相比，電化學(xué)酶聯(lián)免疫傳感器無(wú)放射性污染，試劑便宜且穩(wěn)定，檢測(cè)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，使用方便，構(gòu)制酶電極方法靈活，體系容易集成化，微型化等優(yōu)點(diǎn)［2］，易于在中小型實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)操作，便于普及和推廣，因此近年來(lái)得到了廣泛的應(yīng)用。

2 電化學(xué)酶免疫傳感器在食品安全檢測(cè)中的研究應(yīng)用

基于抗原-抗體特異性結(jié)合的工作原理，結(jié)合酶的催化作用，酶免疫傳感器在食品安全檢測(cè)中有了廣泛的研究應(yīng)用，不但應(yīng)用于食品中生物性危害檢測(cè)，主要包括致病菌、病毒、毒素等，而且在食品的藥物殘留檢測(cè)方面也有不少研究應(yīng)用。

2.1 檢測(cè)食源性病源菌

食源性病源菌是引起人類食物中毒的最主要原因。常見(jiàn)的食源性病源菌有致病性大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等［7-9］。免疫傳感器的出現(xiàn)極大地推進(jìn)了食源性病源菌快速檢測(cè)的發(fā)展，也使食品工業(yè)生產(chǎn)和包裝過(guò)程微生物自動(dòng)檢測(cè)成為可能。馬靜等［10］人建立一種快速檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的新型電化學(xué)酶免疫傳感器。用靜電吸附作用和抗原抗體特異性反應(yīng)將大腸桿菌O157∶H7單克隆鼠抗固定在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG/納米金修飾的玻碳電極表面，制備用于檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的酶免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法和恒電位法測(cè)定大腸桿菌O157∶H7被固定在電極表面引起的電信號(hào)改變進(jìn)行定量分析。Vanessa［11］等用兔免疫球蛋白和酪氨酸酶固定于巰基丙酸膜修飾的金電極表面，利用競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)的檢測(cè)原理對(duì)金葡菌進(jìn)行定量檢測(cè)。傳感器顯示的檢測(cè)范圍為4.4×105～1.8×107cfu/mL，最低檢出限為1.7×105cfu/mL，并且用于牛奶樣品的檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)食品中的毒素

食品中毒素的種類繁多，食品在產(chǎn)前、運(yùn)輸、加工及銷售等環(huán)節(jié)都有可能被污染，而且有些毒性大，很多有致畸、致癌作用。為了防止毒素超標(biāo)的食品和飼料直接進(jìn)入食物鏈，加強(qiáng)對(duì)其檢測(cè)非常必要。黃曲霉毒素是一種常見(jiàn)的霉菌毒素，主要存在于玉米、花生等多種食物中，它是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，常見(jiàn)的幾種黃曲霉毒素的毒性按大小順序排列依次是 B1、M1、G1、B2、G2，B1 是最危險(xiǎn)的致癌物，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為I類致癌物，黃曲霉毒素M1是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，一部分存在于動(dòng)物的可食部分，如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中，其中以乳最為常見(jiàn)。2005年Micheli L［12］等研制了基于絲網(wǎng)印刷電極的免疫傳感器用于AFM1的檢測(cè)，將AFM1抗體固定于電極表面，用酶標(biāo)AFM1抗原與待測(cè)的AFM1與絲網(wǎng)印刷電極表面的AFM抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，從而對(duì)樣品中AFM進(jìn)行檢測(cè)，其最低檢出限為 25PPT，檢出線性范圍為30～160PPT，并直接用于牛奶中AFM1的檢測(cè)。2008年Ai-Li［13］等在玻碳電極表面用咪唑四氟硼酸修飾及二氧化鈦Nafion膜再通過(guò)納米金吸附酶標(biāo)AFB1抗體，制備成用于檢測(cè)AFB1的電化學(xué)酶免疫傳感器，傳感器對(duì)濃度為0.1～12ng/mL的AFB1呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為 0.05ng/mL，與傳統(tǒng)的ELISA相比顯示出良好的準(zhǔn)確性。

2.3 藥物殘留的檢測(cè)

食品中的藥物殘留包括植物產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留和動(dòng)物產(chǎn)品中的獸藥殘留，對(duì)藥物殘留的檢測(cè)主要方法是氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)，這些檢測(cè)方法需有高檔的檢測(cè)儀器及樣品前處理復(fù)雜，無(wú)法用于食品的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因此對(duì)于食品藥物殘留的電化學(xué)酶免疫傳感器有了較多的研究應(yīng)用。

2.3.1 農(nóng)藥殘留的檢測(cè) 農(nóng)藥殘留是指使用農(nóng)藥后，殘存在植物體內(nèi)、土壤和環(huán)境中的農(nóng)藥及其有毒代謝物。農(nóng)藥殘毒就是殘留在食品中的農(nóng)藥毒性。如果未按照國(guó)家安全使用規(guī)定施用農(nóng)藥和進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品采收，或違反國(guó)家規(guī)定使用高毒農(nóng)藥，農(nóng)產(chǎn)品就會(huì)有農(nóng)藥殘毒，就會(huì)對(duì)食用者身體健康造成危害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成身體不適、嘔吐、腹瀉甚至導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重后果。

Wilmer［14］用堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體，用一個(gè)電化學(xué)酶免疫傳感器測(cè)定了水中2，4-二氯苯氧基乙酸的含量，檢測(cè)限為0.1!g/L。

Starodub N F等人［15］用葡萄球菌A蛋白將抗西瑪津的多克隆抗體連接在酶ISFET（離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管）生物傳感器門柵上，通過(guò)2種方式檢測(cè)試樣中的西瑪津（除草劑）：一種是待測(cè)液中同時(shí)存在已知量的被過(guò)氧化物酶標(biāo)記的西瑪津和未知量的待測(cè)西瑪津，二者與ISFET上的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，通過(guò)測(cè)量結(jié)合在ISFET上的酶活性即可確定西瑪津的濃度，此方式的檢測(cè)限為1.25!g/L，線性范圍為5～17!g/L；另一種是先將ISFET插入待測(cè)液中，使抗體與其中的西瑪津充分結(jié)合，然后，再將此ISFET插入含有酶標(biāo)記的西瑪津液中，使未被結(jié)合的抗體與被酶標(biāo)記的西瑪津結(jié)合，通過(guò)測(cè)量結(jié)合在ISFET上的酶活性即可確定西瑪津的濃度，其檢測(cè)限為0.65!g/L，線性范圍為 1.25～18!g/L。

2.3.2 獸藥殘留的檢測(cè) 動(dòng)物性食品中的獸藥殘留問(wèn)題日益受到人們的關(guān)注，獸藥殘留已成為食品安全中最重要的問(wèn)題之一。動(dòng)物性食品中最常見(jiàn)的獸藥殘留是激素和抗生素的殘留。上海交通大學(xué)的朱將偉等根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)酶免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的傳感器在檢測(cè)肉類食品中的激素殘留獲得了較好的效果。其設(shè)計(jì)的己烯雌酚傳感器是由過(guò)氧化氫電極和己烯雌酚抗體膜組成，將一定量的過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的己烯雌酚加到待測(cè)樣品中，酶標(biāo)記的及未標(biāo)記的己烯雌酚會(huì)與膜上的己烯雌酚抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定酶標(biāo)己烯雌酚與抗體的結(jié)合率便可知食品中己烯雌酚的含量［17］。該免疫傳感器檢測(cè)限可達(dá) 8!g/kg，與ELISA法相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間僅為20min。

李孝君［18］等將玻碳電極（GCE）表面氧化處理后，用戊二醛（GA）作交聯(lián)劑，將新亞甲藍(lán)（NMB）及辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的青霉素多克隆抗體（Ab3）修飾到電極表面，制成高靈敏電流型青霉素免疫傳感器，傳感器對(duì)雞肉中含有的青霉素檢測(cè)的線性范圍是5～45ng/g，最低檢出限為1.90ng/g。

3 展望

電化學(xué)酶免疫傳感器已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、檢疫學(xué)等方面，它是酶電極催化放大作用與高靈敏度的電化學(xué)分析及特異性的免疫分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合，具有結(jié)構(gòu)緊湊、使用方便、成本低、檢測(cè)限低、可微型化、信號(hào)倍增等特點(diǎn)，因此在食品安全的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面有廣闊的發(fā)展前景。

［1］何方澤，羅曉琴，李靜.酶聯(lián)免疫技術(shù)在食品安全與藥物殘留中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，15：353-354.

［2］劉夢(mèng)琴，黃勇，劉陽(yáng)，等.電化學(xué)酶聯(lián)免疫傳感器的發(fā)展概述［J］.化學(xué)傳感器，2007，27（1）：3-4.

［3］馬艷平，丁耀忠，金雷，等.生物傳感器在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展及展望［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（1）：21.

［4］韓梅梅，董國(guó)君，孫哲.生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2004，5（8）：84.

［5］范瑾瑾，俞純山.電化學(xué)免疫傳感器測(cè)定Ag-Ab反應(yīng)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，1995，16（4），159-160.

［6］焦奎，張書(shū)圣.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：56-62.

［7］張芳，馬國(guó)柱，潘立，等.陜西省2002-2006年食源性致病菌污染狀況［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2008，24（2）：222-224.

［8］楊修軍，劉桂華，孔祥云，等.2002-2007年吉林省食品中食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢疫雜志，2008，18（7）：1400-1402.

［9］龔霄，陳盼.革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌［ J］.肉類研究，2008（5）：53-60.

［10］馬靜，張偉尉，李聞，等.基于納米金固定大腸桿菌0157∶H7酶免疫傳感器的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（12）：2156-2158.

［11］Vanessa EG，Susana C，Mara P.Immunosensor for the determination of Staphylococcus aureus using a tyrosinasemercaptopropionic acid modified electrode as an amperometric transducer［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391：837-845.

［12］MicheliL，Grecco R，Badea M.An electrochemical immunosensor for aflatoxin M1 determination in milk using screen-printed electrodes［J］.Biosens Bioelectron，2005，21：588-596.

［13］Ai-Li Sun，Qing-An Qi，Zhuang-Long Dong.An electrochemical enzyme immunoassay for aflatoxin B1 based on bio-electrocatalytic reaction with room-temperature ionic liquid and nanoparticle-modified electrodes［J］.Sens&Instrumen Food Qual，2008（2）：43-50.

［14］高志賢，陶桂全，李新如.壓電免疫傳感器用于C-2型葡萄球菌腸毒素的測(cè)定［J］.衛(wèi)生研究，1998（2）：122-124.

［15］Starodub N F，Ivantiev B B，Starodub V W，et al.Immunosensor for the determination of the herbicide simazine based on an iorrselective field effect transistor［ J］.Anal Chim Acta，2000，424：37-43.

［16］朱將偉，柴春彥，劉國(guó)艷，等.檢測(cè)動(dòng)物性產(chǎn)品中殘留己烯雌酚的免疫傳感器的研制［J］.糧食與飼料工業(yè)，2005（7）：44-45.

［17］李孝君，李蘭，馬潔，等.電化學(xué)免疫法測(cè)定雞肉組織中青霉素［J］.應(yīng)用化學(xué)，2009，26（6）：716-720.

Research progress of electrochemical enzyme-linked immunosensor in detection of food safety

DING Jian-ying，SHENG Tang，GU Chun-hai
（Department of Biological and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

TS201.1

A

1002-0306（2010）10-0415-03

2009-09-18

丁建英（1967-），女，講師，研究方向：食品安全快速檢測(cè)。