花生紅衣中多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基能力和抑菌性能的研究

趙 萍，林櫻姬，金征宇，王 雅，王 莉，亓文靜

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

花生紅衣中多酚類物質(zhì)清除DPPH自由基能力和抑菌性能的研究

趙 萍1，2，林櫻姬2，金征宇1，王 雅2，王 莉2，亓文靜2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

研究了花生紅衣多酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力及抑菌性能。將花生紅衣多酚粗提和純化后的物質(zhì)與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品及抗壞血酸的EC50值作比較，得到花生紅衣多酚粗提物EC50（0.194mg/L）＜純化花生紅衣多酚 EC50（0.705mg/L）＜沒食子酸 EC50（0.760mg/L）＜單寧酸的 EC50（5.409mg/L）＜抗壞血酸的 EC50（3.745mg/L）。純化后花生紅衣多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉和毛霉均有抑菌性能，最低抑菌濃度為250mg/L。

花生紅衣，多酚，DPPH自由基，抑菌

Abstract：The bacteriostasis and scavenging DPPH· c apability of the polyphenols extracted from peanut testa were studied.The results showed that scavenging effects on DPPH·of cude peanut testa extract EC5（00.194mg/L）were better than purified polyphenols EC5（00.705mg/L），Gallic Acid EC5（00.76mg/L），Tannic acid EC5（05.409mg/L），∨CEC50（3.745mg/L）.There were antibacterial properties of pure polyphenols from peanut testa，such as Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Penicillium sp.，Actinomucor sp.and Aspergillus niger.The minimum inhibiting concentrations were all 250mg/L.

Key words：peanut testa；polyphenols；DPPH·；bacteriostasic

花生紅衣中富含多酚類化合物，具有抗氧化等生物活性［1］。但在花生加工業(yè)中，花生紅衣仍作為一種經(jīng)濟(jì)效益很低的副產(chǎn)品存在，沒有得到充分的綜合利用［2］。國內(nèi)外對植物資源的研究非?；钴S，從植物中提取的某些活性物質(zhì)具有抗菌、抗氧化和其他生理作用，為植物源防腐劑的發(fā)展提供了物質(zhì)基礎(chǔ)［3-4］。我國學(xué)者研究了大蒜、生姜、丁香等50多種香辛料植物及大黃、甘草、銀杏葉等200多種中草藥及其他植物如竹葉等提取物的抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有150多種具有廣譜的抑菌活性，已經(jīng)作為天然防腐劑在某些食品中作了一些簡單的應(yīng)用。BRANEN［5］提出酚類物質(zhì)對很多細(xì)菌有效；CHANG和 BRANEN報道在真菌培養(yǎng)基中250mg/kg的BHA就可以抑制霉菌生長以及黃曲霉毒素的生成；RACCAH在酚類抗氧化劑抑菌活性文獻(xiàn)綜述中提出：酚類物質(zhì)抑菌能力比較強(qiáng)［6］。而對于花生紅衣中多酚類物質(zhì)是否也同樣具有抑菌效果的研究則比較少。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯花大花生紅衣 山東魯花公司提供，將其粉碎過40目篩，備用；DPPH·（二苯代苦味酰基自由基）、GA（沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品）、單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMAALDRICH.Inc；無水乙醇 山東萊陽市雙雙化工有限公司；維生素C 天津市醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)研究所；鐵氰化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin-C試劑［7］；所用試劑 均為分析純；大腸桿菌（Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers，GSICC 30507）、金黃色葡萄球菌金黃色亞種（Staphylococcus aureus subsp.Aureeus Rosenbach，GSICC 31902） 由甘肅省微生物菌種保藏中心提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspegillus niger）、毛霉（Actinomucor sp.） 由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與食品實(shí)驗(yàn)中心提供。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) JY92-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-9200紫外分光光度計 UVSpectrophtotmeter Cary50 Probe；743 型 Rancimat儀瑞士萬通；電子分析天平 AB104-N梅特勒-托利多儀器有限公司；飛鴿牌臺式離心機(jī)TDL-5-A 上海安亭科學(xué)儀器廠；凍干機(jī)FD-1-55 北京博衣康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生紅衣多酚的制備流程 花生紅衣粉碎篩→超聲細(xì)胞粉碎→離心→減壓濃縮→AB-8大孔樹脂純化→減壓濃縮→凍干

1.2.2 花生紅衣多酚的制備［8］花生紅衣粉碎過40目篩，以70%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶12（g/mL），利用超聲細(xì)胞粉碎儀，功率為240W，超聲提取10min。提取液離心后，棄去沉淀，在30℃下減壓濃縮，蒸去乙醇，得粗提液。粗提液過AB-8大孔樹脂，60%乙醇洗脫，30℃下減壓濃縮，濃縮液至凍干機(jī)冷凍干燥，得純化后多酚產(chǎn)物。

1.2.3 花生紅衣多酚對DPPH·清除能力測定［9-10］DPPH·是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm處有最大吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm波長處的吸光度值變小，這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。由于該分析方法測定簡便、快速，同時DPPH·較長的半衰期使此方法保持了良好的重現(xiàn)性，因此，盡管DPPH·并非人體內(nèi)實(shí)際產(chǎn)生的自由基，對DPPH·的淬滅能力仍然可以有效地評價抗氧化劑的活性，在國內(nèi)外被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選。其能力用清除率（Scavenging Rate，SR）來表示，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.2.3.1 待測液的制備 將未純化的花生紅衣提取物（PTE）和經(jīng)純化的花生紅衣多酚（PPTE，純度64%）、維生素 C（VC）和沒食子酸（GA）、單寧酸（TA）標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成體積分?jǐn)?shù)為0.1mg/mL的無水乙醇溶液（母液），再將所配制的母液按照要求稀釋成不同濃度的溶液。

1.2.3.2 DPPH·溶液的可見光譜 以無水乙醇為對照，精確吸取的DPPH·溶液2mL與2mL無水乙醇混合均勻后，以相對應(yīng)的溶劑（4mL無水乙醇）為對照，用分光光度計測定上述溶液在最大吸收波長下的吸光度值（A0），在分光光度計上對DPPH·溶液進(jìn)行在440～600nm下掃描，確定最大吸收波長為517nm。

1.2.3.3 樣品溶液對DPPH·抗氧化能力測定 精確吸取上述不同濃度的 PPTE溶液2mL，分別與0.025mg/mL的DPPH·溶液2mL和2mL無水乙醇混合，搖勻后放置30min。以相對應(yīng)的溶劑（無水乙醇）為對照調(diào)零，用分光光度計分別測定上述溶液在517nm處的吸光度值（Ai和 Aj），分別測得 Ai和Aj值。

清除率 SR（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100%

其中，Ai：2mL樣液與2mL的DPPH·溶液混合后在波長最大吸收波峰處的吸光度值；Aj：2mL樣液與2mL無水乙醇溶劑混合后在波長最大吸收波峰處的光值；A0：2mL DPPH·溶液與2mL無水乙醇溶劑混合后在波長最大吸收波峰處的吸光度值。

1.2.4 花生紅衣多酚抑菌性能的測定

1.2.4.1 培養(yǎng)基的制備 將配制好的各種菌株的培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（121℃、15min），冷卻至 50～60℃，采用無菌操作傾注于干熱滅菌（160℃、3h）過的培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿裝15～20mL（培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度約3～5mm），制備充足數(shù)量的菌種（每個供試菌種、每種多酚濃度做3個重復(fù)），放入4℃冰箱保存，不超過2d。

供試菌株懸浮液的制備：分別用接種針挑取少許菌體接種于裝有玻璃珠及50mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩10min，制成均勻的菌懸浮液。調(diào)整菌懸浮液的濃度，使其含孢子或菌體量在106～107個/mL之間。分別用滅菌的移液槍向凝固的平板上加0.1mL菌體懸浮液，用無菌三角玻璃刮鏟涂布均勻。

1.2.4.2 菌液的制備 用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體或孢子放入裝有50mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，在微型漩渦混合機(jī)上充分混勻，制成菌體懸液或孢子懸液備用。

1.2.4.3 PPTE抑菌活性測定-濾紙片法 用打孔器將濾紙打成10mm的圓片，把濾紙圓片用稱量紙包好，每片稱量紙隔開放兩片在培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿包好，用干熱滅菌法滅菌（160℃、3h），分別置于不同濃度的PPTE水溶液中浸泡10min；瀝去多余試液，用無菌鑷子放在涂好菌液的培養(yǎng)基上。對照用0.85%的無菌生理鹽水浸泡。用無菌鑷子鑷取濾紙圓片，沿瓶壁瀝去多余的PPTE溶液，采用無菌操作置于已用菌液涂布好的培養(yǎng)皿中。每個供試菌種做3個平行。每個培養(yǎng)皿中十字形對稱放置 4 張濾紙圓片，分別用 5、3、1、0.5、0.25、0.1g/L PPTE溶液浸泡及0.85%無菌生理鹽水（對照）浸泡。細(xì)菌、平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；霉菌倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，取出觀察有無抑菌作用，培養(yǎng)結(jié)束后，用刻度尺測試培養(yǎng)基中抑菌圈的直徑。

1.2.4.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定［11］參考以上方法，對幾種菌采用6種濃度的PPTE做最佳最小濃度抑菌實(shí)驗(yàn)。每株菌、每個平皿用無菌打孔器有規(guī)律地均勻打6個孔，其中一個作為對照（無菌0.85%生理鹽水），其它加5種不同濃度的PPTE溶液。每種菌的每種濃度的PPTE做6個平行，觀察結(jié)果，以不長菌的最低提取物溶液濃度為該提取物的最低抑菌濃度，以其平均值作為抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生紅衣多酚對DPPH·清除能力測定

通過表1可以看出，PTE、PPTE、維生素C和沒食子酸對DPPH·都有一定的清除率，且PTE的EC50＜PPTE的EC50＜沒食子酸的EC50＜抗壞血酸的EC50＜單寧酸的EC50，說明花生紅衣多酚的清除自由基的能力比抗壞血酸、單寧酸和沒食子酸強(qiáng)，這可能是由于花生紅衣多酚中存在一些其他抗氧化性強(qiáng)的物質(zhì)。從表中可以看出，經(jīng)大孔樹脂純化后的花生紅衣多酚的EC50值與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的EC50值相近，可以看出花生紅衣經(jīng)純化后，純品的自由基清除能力已接近沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品。而PTE的抗氧化性強(qiáng)于純化后花生紅衣多酚，主要原因可能是多酚類物質(zhì)比較敏感，易分解變質(zhì)，由于經(jīng)過一系列的純化過程，失去了其他物質(zhì)的協(xié)同作用、自身的抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生變化，造成抗氧化活性的損失。而PTE與各單體之間可能存在相互間的作用與協(xié)同，使抗氧化能力增強(qiáng)。

表2 PPTE抑菌圈直徑（mm）

表3 PPTE最低抑制濃度

表1 PTE、PPTE、GA、TA 和 VC清除DPPH·回歸方程及EC50值比較

2.2 PPTE的抑菌效果

由表2可知，PPTE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌，黑曲霉、毛霉、青霉等真菌有明顯抑制作用，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、毛霉抑制作用比較明顯，當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L以上時，既有明顯的抑菌圈產(chǎn)生，且抑菌能力隨濃度增加而增強(qiáng)，隨濃度逐步增加抑菌圈直徑相應(yīng)地增大。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）

由表3可知，PPTE對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉、葡萄球菌的最低抑制濃度均為250mg/L。

3 結(jié)論

3.1 PTE對DPPH·具有較好的清除作用，半清除濃度PTE為0.194mg/L，PPTE為0.705mg/L。PPTE半清除度已接近沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品；而PTE的半清除度強(qiáng)于沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品。因此，花生紅衣提取物可以作為一種功能性抗氧化添加劑，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 PPTE對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉、黑曲霉、毛霉和葡萄球菌的生長具有一定的抑制作用，最低抑菌濃度均為250mg/L，且抑菌圈大小隨濃度的增加而增大。

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Study on capability of scavenging DPPH·and bacteriostasic activity of polyphenols from peanut testa

ZHAO Ping1，2，LIN Ying-ji2，JIN Zheng-yu1，WANG Ya2，WANG Li2，QI Wen-jing2
（1.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0129-04

2009-10-15

趙萍（1964-），女，博士研究生，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后貯藏加工研究。

甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃（0803RJZA044）。