食品中低聚異麥芽糖高效液柑色譜檢測(cè)方法研究

傅博強(qiáng)，王 晶，*，唐治玉，王遠(yuǎn)興，謝明勇，付芳圓

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，生物、能源與環(huán)境研究所，北京100013；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌321005）

食品中低聚異麥芽糖高效液柑色譜檢測(cè)方法研究

傅博強(qiáng)1，王 晶1，*，唐治玉1，王遠(yuǎn)興2，謝明勇2，付芳圓1

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，生物、能源與環(huán)境研究所，北京100013；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌321005）

針對(duì)乳制品、固體飲料、糖果、保健品等食品中添加的功能活性成分低聚異麥芽糖，包括異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）、異麥芽四糖（IG4）的檢測(cè)，建立了水和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，氨基色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light-scattering detector，ELSD）檢測(cè)食品中添加的低聚異麥芽糖含量的高效液相色譜方法。異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的線性工作范圍分別為 0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為1、0.9999、0.9998、0.9999。對(duì)不同類型的食品，四種低聚異麥芽糖的回收率在98.0%～105.0%之間，方法準(zhǔn)確度高。室內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)一般都低于10%；除了含量低的異麥芽四糖，室間再現(xiàn)性變異系數(shù)一般都低于10%，說明方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。該方法簡(jiǎn)單、易于掌握，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適于復(fù)雜食品基質(zhì)中低聚異麥芽糖含量的測(cè)定。

食品，低聚異麥芽糖，高效液相色譜法，含量測(cè)定

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosacharide，簡(jiǎn)稱IMO）是淀粉糖的一種，是葡萄糖基以α-1，6糖苷鍵結(jié)合而成單糖數(shù)為2及以上（Gn）的一類低聚糖，其主要成分為異麥芽糖（Isomaltose）、潘糖（Panose）、異麥芽 三 糖（Isomaltotriose）及 異 麥 芽 四 糖（Isomaltotetraose）等［1］。低聚異麥芽糖廣泛存在于大麥、小麥和馬鈴薯等植物中，在醬類、蜂蜜及果葡糖漿中也有少量存在。商品低聚異麥芽糖產(chǎn)品規(guī)格主要有兩種：IMO-50型（IG2+P+IG3+Gn≥50%）和IMO-90型（IG2+P+IG3+Gn≥90%）。IMO-50型含有一定量葡萄糖、麥芽糖；而IMO-90型含葡萄糖和麥芽糖較少，產(chǎn)品純度較高［1］。低聚異麥芽糖屬于非消化性低聚糖類，難以被胃酶消化，具有水溶性膳食纖維功能，其熱量低，基本上不增加血糖血脂，有助于維持腸道正常細(xì)菌群平衡，改善腹瀉與便泌，提高機(jī)體免疫力［2］。鑒于低聚異麥芽糖的特性和保健功能，其已被日益廣泛應(yīng)用于保健品、食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域［3］。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中添加的低聚異麥芽糖含量的準(zhǔn)確定量，需要建立適用性強(qiáng)的檢測(cè)方法。不同聚合度IMO結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，GB/T 22224 -2008中采用的凝膠柱無法實(shí)現(xiàn)有效的分離分析。我國《低聚異麥芽糖》產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20881-2007中，對(duì)低聚異麥芽糖糖漿和糖粉中的各種低聚異麥芽糖的含量采用TSKgel Amide-80氨基鍵合柱，乙腈∶水（67∶33）作為流動(dòng)相、流速1.0mL/min、柱溫75℃，外標(biāo)法進(jìn)行定量［1］。對(duì)食品中添加的低聚異麥芽糖測(cè)定，李黎等［4］采用氨基色譜柱、乙腈∶水（67∶33）作為流動(dòng)相、流速1.0mL/min、柱溫40℃分離測(cè)定沖劑和干吃鮮奶片等食品中的低聚異麥芽糖，平均回收率為97.27%，樣品測(cè)定值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.53%～7.89%（n=5）。陳桂茹等［5］使用300mm×4.6mm的Hypersil氨基柱，乙腈∶水（78∶22）為流動(dòng)相，內(nèi)部溫度為40℃的示差檢測(cè)器，測(cè)定飲料中低聚異麥芽糖的含量，異麥芽糖和異麥芽三糖的回收率范圍分別為88.5%～101.0%、90.1%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 ＜5%。食品基體成分復(fù)雜，只能采用等度洗脫的示差折光檢測(cè)器已不能滿足不同基體食品中低聚異麥芽糖含量的測(cè)定，本研究以酸性乳飲料、口服液和果凍作為研究對(duì)象，建立了水和乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，氨基色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分析檢測(cè)食品中添加的低聚異麥芽糖含量的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石油醚（30～60℃） 分析純；異麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、潘糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） Sigma公司，分析純；異麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、異麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%） 美國US Biological公司，分析純；乙腈 Fisher公司，色譜純；酸性乳飲料、口服液、果凍樣品 市售，購自北京市某超市。

100、1000μL移液器 美國ephendof公司；50mL Teflon具螺紋蓋離心管 美國 nunc公司；孔徑0.45μm的有機(jī)相微孔濾膜、1.0mL一次性無菌注射器、空氣發(fā)生器 國產(chǎn)；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng) 配有四元高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站和35900E數(shù)模轉(zhuǎn)換器，美國安捷倫公司；Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國 Grace公司；ME235S sartorious電子天平（感量0.0mg）、CP324S Ssartorious電子天平（感量0.1mg） 北京賽多利斯天平有限公司；pc 420D磁力加熱攪拌器 北京康林科技有限責(zé)任公司；DZF-6050真空干燥箱 上海博訊事業(yè)責(zé)任有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；IKA MS2旋渦混合器 德國；CQ25-12D超聲波清洗機(jī) 上海新芝儀器責(zé)任有限公司；3k30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國SIGMA公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；MiLLi-Q超純水制備系統(tǒng) 美國MILLIPORE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 低聚異麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品各約5mg（精確至0.01mg）至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混合均勻，稱重（精確至0.1mg），得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱中可穩(wěn)定保存1個(gè)月。濃度用質(zhì)量濃度表示（mg/g）。

1.2.1.2 低聚異麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用移液器分別準(zhǔn)確移取低聚異麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液250、500、1000μL，稱重（精確至0.1mg），分別補(bǔ)加水750、500、0μL，得到濃度分別為0.125、0.25、0.5mg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃冰箱中可穩(wěn)定保存1個(gè)月。

1.2.2 樣品的預(yù)處理

1.2.2.1 樣品的干燥處理 對(duì)奶粉、豆粉等固體粉末狀樣品，如果計(jì)算占干物質(zhì)的含量，需要依據(jù)GB/T 5009.3-2003《食品中水分的測(cè)定》測(cè)定水分含量。

1.2.2.2 樣品的脫脂處理 對(duì)脂肪含量大于20g/100g的樣品如奶粉、豆粉，需進(jìn)行脫脂處理。方法如下：稱取1.5g干燥后的樣品，精確至0.1mg。放在50mL離心管中，加40mL石油醚，磁力攪拌器攪拌30min，冰箱中冷卻10min。3000r/min（離心力1620×g）離心5min，棄掉上清液，重復(fù)以上步驟2次。將離心管蓋子打開，在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)殘存的石油醚，然后放入60℃真空干燥箱干燥2h，研磨成粉末。稱量脫脂干燥后的樣品，精確至0.1mg，計(jì)算脂肪含量。

1.2.3 樣品的提取

1.2.3.1 固態(tài)樣品 稱取經(jīng)干燥、脫脂處理的奶粉或豆粉1.2g左右（精確稱量至0.1mg），放在50mL離心管中。加 10mL 80℃熱水，在 80℃水浴中提取10min，在0、5、10min時(shí)用渦旋儀分別渦旋10s。取出后，冷卻至室溫。加10mL乙腈，劇烈振蕩5min，靜置30min，8000r/min（離心力6010×g）離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.2 液態(tài)乳制品樣品 準(zhǔn)確吸取12.5mL酸性乳飲料，放在50mL離心管中。與同體積的乙腈混合，充分振搖5min后靜置30min，8000r/min（離心力6010×g）離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至25mL容量瓶中。在離心的沉淀中再加入3mL 80℃熱水和2mL乙腈，充分振搖后靜置，8000r/min離心5min，將兩次的上清液合并。提取液用0.45μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.3 口服液 準(zhǔn)確吸取一定體積的口服液，用50%的乙腈定容至25mL容量瓶中。從此溶液中取一定體積的溶液，用50%乙腈稀釋至合適的濃度（使低聚異麥芽糖的濃度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，即0.1～0.65mg/mL）。用0.45μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.3.4 糖果類（果凍） 稱量1.0g果凍，精確稱量至0.1mg，置于50mL離心管中。加10mL 80℃熱水，在80℃水浴中提取10min，在0、5、10min時(shí)用渦旋儀分別渦旋10s。取出后，冷卻至室溫。加11mL乙腈，劇烈振蕩5min，靜置30min，6010×g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加水定容至刻度。取1.5mL用0.45μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，所得濾液供HPLC分析。

1.2.4 色譜分析條件

1.2.4.1 高效液相色譜分離條件 色譜柱：Alltech PrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱（4.6mm × 250mm，5μm），保護(hù)柱（4.6mm×20mm，5μm，美國Grace公司）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：乙腈，B：水。

梯度洗脫程序見表1、表2。

表1 只含低聚異麥芽糖食品樣品的梯度洗脫程序

表2 同時(shí)含低聚異麥芽糖和低聚果糖的食品樣品的典型梯度洗脫程序

對(duì)不同的食品基體，洗脫條件進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.4.2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分析條件 對(duì) Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，設(shè)定漂移管溫度87℃，載氣流速2.3mL/min。

1.2.5 測(cè)定方法 在1.2.4.1色譜條件下測(cè)定系列低聚異麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的響應(yīng)值（峰面積），以濃度為橫坐標(biāo)，低聚異麥芽糖的峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制4種低聚異麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用二次方程對(duì)曲線進(jìn)行擬合，得到校準(zhǔn)工作曲線二次線性回歸方程。

取10μL樣品溶液注入高效液相色譜儀，測(cè)定試樣的響應(yīng)值（峰面積）。由4種低聚異麥芽糖的校準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品溶液中低聚異麥芽糖的濃度。

1.2.6 結(jié)果計(jì)算 樣品中異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的含量按下式計(jì)算：

式中：X-異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的含量，單位為mg/100g樣品；ci-由校準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程計(jì)算得到的異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；V-樣品定容的體積，單位為mL；DF-稀釋因子，即待測(cè)的樣品溶液被稀釋的倍數(shù)；m-脫脂后樣品的稱樣量，單位為g；F-樣品的脂肪含量，單位為%。

平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

不同于紫外和示差折光檢測(cè)器，ELSD檢測(cè)器的響應(yīng)值（Y）與被測(cè)物濃度（X）的關(guān)系曲線比較復(fù)雜，在低濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)值與被測(cè)物濃度為二次函數(shù)關(guān)系，即Y=aX2+bX+c，在較高濃度范圍內(nèi)，才大致呈線性［6］。食品中添加的低聚異麥芽糖的量都不高，因此，本研究的校準(zhǔn)工作曲線采用二次方程進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖的線性工作范圍分別為0.1～0.45mg/mL、0.1～0.45mg/mL、0.2～0.65mg/mL、0.1～0.35mg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為1、0.9999、0.9998、0.9999，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，見圖1。

圖1 異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）、異麥芽四糖（IG4）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 不同類型食品中低聚異麥芽糖高效液相色譜分析譜圖

對(duì)不同類型的食品，其中各種營養(yǎng)成分的組成和含量各不相同，因此需要對(duì)流動(dòng)相的比例和洗脫程序進(jìn)行調(diào)整，以保證四種低聚異麥芽糖與食品基體中干擾成分，尤其是碳水化合物類的其它低聚糖實(shí)現(xiàn)有效的分離。酸性乳飲料、口服液和果凍中低聚異麥芽糖的分析譜圖見圖2～圖4。果凍樣品中同時(shí)含有低聚異麥芽糖和低聚果糖，它們的性質(zhì)相近，因此會(huì)干擾彼此的分離。通過優(yōu)化乙腈的起始濃度和洗脫梯度的變化速度，可以將低聚異麥芽糖與低聚果糖（蔗果三糖GF2、蔗果四糖GF3、蔗果五糖GF4）有效分離，見圖4。

圖2 酸性乳飲料中低聚異麥芽糖高效液相色譜分析譜圖

2.3 方法的檢出限

Study on determination of isomaltooligosaccharides in foods by high performance liquid chromatography method

FU Bo-qiang1，WANG Jing1，*，TANG Zhi-yu1，WANG Yuan-xing2，XIE Ming-yong2，F(xiàn)U Fang-yuan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 321005，China）

For the determination of isomaltooligosaccharides in foods such as dairy products，solid drinking，candy and healthy food，a high performance liquid chromatography method was established.lsomaltose（lG2），panose（P），isomaltotriose（lG3）and isomaltotetraose（lG4）in various foods were separated on a NH2column by gradient elution and detected by evaporative light-scattering detector（ELSD）.The linear ranges of the calibration curves for lG2，P，lG3and lG4were 0.1～0.45mg/mL，0.1～0.45mg/mL，0.2～0.65mg/mL and 0.1～0.35mg/mL，respectively. The linear correlation coefficients（R2）were 1，0.9999，0.9998 and 0.9999，respectively.As to different kinds of foods，the spike recoveries were in the range of 98.0%～105.0%.Coefficient variability of repeatability and reproducibility were less than 10%，respectively，except the reproducibility of isomaltotetraose.The method was simple and was apt to be grasped，can be used in the quantification of isomaltooligosaccharides in complex food matrix.

food；isomaltooligosaccharides；high performance liquid chromatography；content determination

TS247

A

1002-0306（2010）10-0388-05

2010-08-18 *通訊聯(lián)系人

傅博強(qiáng)（1975-），男，博士，副研究員，研究方向：食品及生物計(jì)量。

國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)國標(biāo)委（20071141-T-469）。