插入序列在水稻白葉枯病菌防治上的研究進(jìn)展

佘宇佳，高必達(dá)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

1 水稻白葉枯病的危害

水稻白葉枯病（Xanthomonas，oryzae pv.oryzae，簡(jiǎn)稱(chēng)Xoo）最早發(fā)現(xiàn)于1884年日本福崗地區(qū)，現(xiàn)已是一種世界性的重要細(xì)菌病害[1-2]。從20世紀(jì)中葉以來(lái)，發(fā)病范圍逐步擴(kuò)大，在亞洲、非洲、歐洲、美洲均有發(fā)生，且以亞洲發(fā)生最為嚴(yán)重。而我國(guó)主要發(fā)生在華東、華中、華南稻區(qū)，在其他部分稻區(qū)也有零星分布[3]。水稻白葉枯病菌是由革蘭氏陰性菌黃單孢水稻變種引起的一種維管束病害[4]。病原菌經(jīng)傷口或水孔等進(jìn)入寄主維管束，在木質(zhì)部中大量繁殖，然后通過(guò)維管束蔓延至整個(gè)植株，最后導(dǎo)致病害不斷擴(kuò)大加重[5]。白葉枯病在潮濕和低洼地區(qū)發(fā)病比較頻繁，一般秈稻重于粳稻，雙季晚稻重于雙季早稻，單季中稻重于單季晚稻，矮稈闊葉品種重于高稈窄葉品種，不耐肥品種重于耐肥品種。水稻在幼穗分化期和孕期易感病。受災(zāi)后的水稻葉片枯萎，光合作用受到妨礙，稻穗的充實(shí)率降低，致使不實(shí)粒增加，同時(shí)造成米質(zhì)疏松脆裂，食味降低。一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)能夠達(dá)到50%，甚至不能抽穗導(dǎo)致絕收[5]。

2 插入序列

1989年世界上首次報(bào)道插入序列（Insertion sequence，簡(jiǎn)稱(chēng)IS），至今在原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)500種不同的IS。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因、在基因組中存在一個(gè)或多個(gè)插入位點(diǎn)的小分子DNA片段常被稱(chēng)為插入序列，廣泛存在于原核和真核生物界中，同時(shí)細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的重要組成部分[6]。IS在細(xì)菌基因組能編碼、自主進(jìn)行轉(zhuǎn)座、插入位點(diǎn)隨機(jī)、插入后使宿主染色體的插入位置上產(chǎn)生短的正向重復(fù)序列等。這些都能造成宿主基因缺失或誘發(fā)突變，以致同源宿主差異的產(chǎn)生。所以IS對(duì)那些具有使植物染病能力的細(xì)菌在不同環(huán)境的生存起著重要作用，且常被作為一種標(biāo)記物用來(lái)鑒定細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)特征[7]。

IS的兩大特征是：（1）插入序列在插入靶位點(diǎn)，造成左右兩端的重復(fù)；（2）插入序列在插入靶位點(diǎn)上自身終端序列都會(huì)生成較短的反向重復(fù)序列（Inverted repeat，IR）。大多數(shù) IR 為 10～40 bp 左右，分為兩個(gè)功能區(qū)域，一個(gè)是發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)的斷開(kāi)之處，長(zhǎng)度只有2～3 bp，另一個(gè)對(duì)特異性序列進(jìn)行識(shí)別，與T轉(zhuǎn)座酶相連接。IS的轉(zhuǎn)座的概率是極小的、插入位點(diǎn)隨機(jī)，與自發(fā)突變率同一個(gè)數(shù)量級(jí)，其精確切離可誘發(fā)的突變回復(fù)為野生型，不精確切離可能會(huì)導(dǎo)致兩端相連的基因沉默或缺失。

3 IS在防治水稻白葉枯病中的重要性

水稻白葉枯病是危害我國(guó)水稻生產(chǎn)的主要病害之一，傳統(tǒng)的化學(xué)防治難以對(duì)水稻白葉枯菌奏效，種植抗病品種是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外普遍使用的防治方法。水稻抗病性的遺傳研究始于日本，至今已有近30種水稻白葉枯抗性基因從不同的水稻品種和野生稻中鑒定出來(lái)，其中許多被用于水稻育種和疾病控制[8]。我國(guó)主要栽培品種所帶有的抗白葉枯病基因源主要為Xa3（粳稻）和Xa4（秈稻）。但長(zhǎng)時(shí)間、大規(guī)模種植單一抗源的品種必將引起病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化，產(chǎn)生新小種，導(dǎo)致品種抗性的喪失。如印度尼西亞，印度，菲律賓和我國(guó)稻區(qū)大量種植帶有單一Xa4抗源的品種，已造成白葉枯病源菌小種的發(fā)生改變，導(dǎo)致這個(gè)抗性基因在我國(guó)部分稻區(qū)已基本喪失抗性。

從進(jìn)化上看，基因的內(nèi)部IS水平轉(zhuǎn)移和重復(fù)序列的增加或缺失是植物病原細(xì)菌致病性變異的主要途徑。利用位點(diǎn)克隆和轉(zhuǎn)座子標(biāo)定技術(shù)已分離出多種新的植物抗病基因，其中包括水稻抗白葉枯病的Xa21和Xa1基因。弄清基因、IS與毒力的相互關(guān)系是快速鑒定、區(qū)分Xoo致病型的前提，同時(shí)也是當(dāng)前防治水稻白葉枯病的重要策略。Ardales等[9]在對(duì)日本白葉枯病菌株MAFF311018進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)基因組中包含大量的插入序列和無(wú)毒基因，病菌的致病型和通過(guò)由插入序列獲得的病菌進(jìn)化分類(lèi)存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系。Ochiai、Ardales等分別以IS1112、IS1113為探針對(duì)斯里蘭卡和菲律賓水稻白葉枯病菌的研究，證實(shí)了插入序列與病菌的致病型之間存在一定的相關(guān)性。由此可見(jiàn)插入序列在基因組進(jìn)化中具有重要作用，與水稻白葉枯病菌的致病型的分化，毒力強(qiáng)弱等有相關(guān)聯(lián)系，這對(duì)研究插入序列提供了良好的基礎(chǔ)。因此，全面分析IS、比較各菌株之間IS的分布差異及其整合特性對(duì)研究不同國(guó)度及區(qū)域的白葉枯病菌的毒力分化，以及抗病品種的合理布局、輪換和相互間的交流，都具有十分重要的意義。

4 水稻白葉枯病菌各致病型的鑒定方法

水稻白葉枯病是一種利用寄主的抗性能夠有效控制危害的細(xì)菌病害，與其寄主水稻是協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。方中達(dá)[10]從全國(guó)各病區(qū)采集了835個(gè)菌株，將其分為了7個(gè)致病型。而王春蓮等[11]發(fā)現(xiàn)我國(guó)同一區(qū)域白葉枯病原菌發(fā)生了變化，并推測(cè)病原菌的變化可能是大面積種植的水稻感染了其他類(lèi)型的致病型，研究表明水稻白葉枯病原菌的群落結(jié)構(gòu)隨著抗性品種的種植而發(fā)生了改變。

對(duì)于水稻白葉枯病原菌致病型的鑒定可以通過(guò)生理特征、生化性質(zhì)、毒性以及分子水平等不同角度來(lái)衡量，但各有不足。如生理生化手段是建立在菌株外在生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上的，在不同的條件下，不同的實(shí)驗(yàn)操作、分析下會(huì)導(dǎo)致不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因?yàn)樵赬oo中與致病力相關(guān)的某些蛋白是可誘導(dǎo)表達(dá)的，Tsuge等[12]發(fā)現(xiàn)Xoo中的一些蛋白在特定的培養(yǎng)基上才能表達(dá)。

從分子角度來(lái)看，對(duì)Xoo全基因組測(cè)序無(wú)疑是最精準(zhǔn)的方法?；蚪M是用于描述生物的全部基因和染色體組成，將Xoo的全基因組測(cè)序可以破譯其全部遺傳信息，這對(duì)研究Xoo自身遺傳信息和結(jié)構(gòu)、Xoo與相關(guān)寄主因子及其致病性，培育抗病新品種水稻有著極其重要的意義?；虻慕Y(jié)構(gòu)和功能分析，將使人們深入認(rèn)識(shí)及Xoo的侵染及水稻抗病的機(jī)理，大規(guī)模的試驗(yàn)技術(shù)也將會(huì)使人們有更多機(jī)會(huì)篩選到更好的抗性基因，這也是控制水稻白葉枯病害的更加安全和經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前已徹底完成全基因序列測(cè)定并公布的有3個(gè)水稻白葉枯病小種：日本菌株MAFF311018，韓國(guó)菌株KACC 10331和菲律賓菌株P(guān)XO99A。比較分析3種水稻白葉枯病基因組，發(fā)現(xiàn)MAFF和KACC的基因組總的來(lái)說(shuō)在基因含量和組織結(jié)構(gòu)上都高度地相似，而PXO99A與MAFF、KACC差異甚大。Ochiai等在測(cè)定MAFF全序列時(shí)也將IS做了分類(lèi)統(tǒng)計(jì)：共有25種類(lèi)型多達(dá)611個(gè)插入序列，其中386個(gè)為完整IS，225個(gè)為不完整IS，這些序列總和占到菌株全基因序列的10%（MAFF全序列為4 940 217 bp）。Xoo屬于高適應(yīng)性種類(lèi)，在不同的環(huán)境下能分化出不同的致病型，所以想要測(cè)定所有致病型的全基因組序列幾乎是不可能的。對(duì)基因組上特定位點(diǎn)序列的比較是一個(gè)相對(duì)容易且成本低廉的方法，通過(guò)對(duì)存在差異性的位點(diǎn)研究分析，可以探明它們的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

白葉枯病原菌的分類(lèi)長(zhǎng)期采用的是植物病理學(xué)的方法，將寄主上抗性反應(yīng)型來(lái)劃分致病型。但隨著分子生物學(xué)的興起，近20年，國(guó)內(nèi)外研究白葉枯病原菌多樣性的手段逐步變?yōu)橐訰FLP與PCR為主。對(duì)IS的拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)的研究大多采用的是RFLP、Southern雜交rep-PCR、和IS-PCR技術(shù)。Rep-PCR和IS-PCR均利用IS多拷貝序列上的部分序列作引物來(lái)擴(kuò)增IS及其旁側(cè)序列，通過(guò)分析不同種群中的差異來(lái)研究種群之間的遺傳多樣性。這些PCR方法雖然能形成直觀的指紋圖譜但靈敏度不高，而PCR技術(shù)檢測(cè)周期長(zhǎng)、假陽(yáng)性現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這些對(duì)IS研究有一定的局限性。RFLP與Southern印跡雜交的方法是測(cè)定基因拷貝數(shù)、遺傳圖譜構(gòu)建、分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的標(biāo)準(zhǔn)方法。其特點(diǎn)是：數(shù)據(jù)多態(tài)信息量大，呈共顯性標(biāo)記，不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件、發(fā)展階段及組織部位影響，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，探針多。但這些都十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力。特別遇到一個(gè)插入位點(diǎn)有多拷貝的TDNA片段插入時(shí)，用Southern雜交在酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生相似的DNA片段，電泳分析時(shí)很難分辨清楚。而絕大數(shù)的IS拷貝數(shù)眾多且插入位點(diǎn)復(fù)雜，用RFLP、Southern雜交進(jìn)行測(cè)定拷貝數(shù)難以得到真實(shí)準(zhǔn)確的結(jié)果。易用性日益成為主要的核酸定量檢測(cè)技術(shù)，隨著科技的發(fā)展，功能更強(qiáng)大、更特異、更靈敏的熒光標(biāo)記染料不斷出現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將在水稻白葉枯菌的遺傳多樣性研究中得到廣泛的運(yùn)用。

5 展望

水稻與白葉枯病原菌互作符合基因?qū)虻年P(guān)系[13]，這使得對(duì)水稻白葉枯病的研究已成為研究寄主和病原物互作的模式，當(dāng)今對(duì)于水稻白葉枯菌的研究主要集中在白葉枯菌致病性基因和遺傳多樣性上。IS是一個(gè)能自行轉(zhuǎn)座的小DNA片段，它的移動(dòng)能造成鄰近基因的改變，從而使生物體生物學(xué)性狀產(chǎn)生變化。所以對(duì)水稻白葉枯菌的IS的研究有利于更好的區(qū)分水稻白葉枯菌各個(gè)不同的致病型及掌握它們的特征。其中水稻白葉枯菌中IS的拷貝數(shù)、靶標(biāo)位點(diǎn)及其旁側(cè)序列是區(qū)分不同致病型的重要方面。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由于其靈敏性及

[1]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所.中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害 [M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[2]Mew，T W.Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice[J].Annu.Rev.Phytopathol，1987，25：359-382.

[3]王金生.分子植物病理學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[4]Ronald P，Leung H.the rice genome：The most precious thingsare not jade and pearls[J].Science，2002，296：58-59.

[5]劉曉輝.水稻白葉枯病菌毒力分化及遺傳多樣性研究 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，2005.

[6]Mahillon J，Leonard C，Chandler M.IS elements as constituents of bacterial genomes[J].Res Microbio，1999，150：675-687.

[7]Jacques M，Michael C.Insertion Sequences [J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，725-774.

[8]陳功友，鄒麗芳，王刑平，等.水稻白葉枯病菌致病性分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（9）：1301-1307.

[9]Ardales E Y，Leung H，Vera C M，et al.Hierarchical analysis of spatial variation of the rice bacterial blight pathogen across diverse agroecosystems in the Philippines[J].Phytopathology，1996，86：241-252.

[10]方中達(dá)，過(guò)崇儉.中國(guó)水稻白葉枯病菌致病型的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1990，20（2）：81-88.

[11]王春蓮.水稻白葉枯病原菌致病型及其群體遺傳多樣性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2000.

[12]Tsuge S，F(xiàn)urutani A，F(xiàn)ukunaka R，et al.Expression of Xanthomonas，oryzae pv.oryzae hrp genes in a novel synthetic medium，XOM2.J.Gen[J].Plant Pathol，2002，68：363-371.

[13]Keen N T.Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions[J].Annu Rev Genet，1990，24：447-463.