益生注射液抗大鼠移植心缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

李 明，嚴(yán)律南

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科 400016;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院普外科，成都 710032)

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心臟移植模型，并用益生注射液進(jìn)行供體心臟的冷藏保存和心臟移植后受體的早期治療，了解該藥對移植心臟的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是否具有保護(hù)作用。旨在驗(yàn)證以前的研究結(jié)果，并為臨床器官保存和器官移植后應(yīng)用該藥提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性封閉群SD大鼠 20只，2～3月齡，體質(zhì)量(220±20)g，均購自華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 藥品與試劑 益生注射液(規(guī)格 20 mg/m L，批號990705，成都市藥物制劑研究所提供);丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒:各100人份(購自南京建成公司)。

1.3 器械與儀器 顯微外科手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠SSW-3手術(shù)顯微外科器械);UV-1601PC紫外分光光度儀(日本島津)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用大鼠心臟移植模型[1]，將封閉群SD大鼠20只隨機(jī)分為兩組，供心切取時(shí)，對照組供心用4℃肝素生理鹽水(肝素濃度為50 u/m L)進(jìn)行灌注降溫，而實(shí)驗(yàn)組供心用4℃含益生注射液的肝素生理鹽水進(jìn)行灌注降溫(益生注射液濃度為0.5 mg/m L，肝素濃度同對照組);供心取下后，對照組置于4℃生理鹽水中保存，3 h后行心臟移植，術(shù)后不給任何藥物處理;而實(shí)驗(yàn)組供心置于4℃含益生注射液的生理鹽水(益生注射液濃度為0.5 mg/m L)中保存，3 h后行心臟移植;術(shù)后每天腹腔注射益生注射液，劑量為8 mg/kg，連續(xù)9 d;兩組均在冷藏保存3 h后，進(jìn)行心臟移植。分別采集受體術(shù)前和術(shù)后1、3、5、7、9 d 血液，檢測丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。

表1 兩組大鼠心臟移植后血漿MDA和SOD測定結(jié)果()

表1 兩組大鼠心臟移植后血漿MDA和SOD測定結(jié)果()

#:P＜0.05，與術(shù)前比較。*:P＜0.05，與對照組同一時(shí)間點(diǎn)比較。

組別 檢測指標(biāo) 術(shù)前 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d 術(shù)后9 d對照組(n=5) MDA(nmol/ml) 18.17±0.91 45.27±6.48# 40.85±4.40 36.20±4.57 25.89±4.82 17.75±1.31 SOD(Nu/mL) 734.61±43.37 529.77±46.31# 588.79±73.48 621.67±68.99 675.37±71.73 715.22±72.24實(shí)驗(yàn)組(n=5) MDA(nmol/mL) 17.53±0.90 32.78±6.61*# 27.40±6.06* 23.28±5.84* 17.80±1.52* 17.45±1.10 SOD(Nu/mL) 731.00±43.19 663.33±45.92*# 704.52±38.48* 735.00±40.26* 783.60±37.10* 729.46±47.24

1.4.2 觀察指標(biāo)及方法

1.4.2.1 丙二醛測定 丙二醛(MDA)測定采用 TBA(硫代巴比妥酸)法，利用過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在 532 nm處有最大吸收峰，用 UV-1601PC(日本津島)紫外分光光度儀在532 nm處檢測其吸光度，利用公式可計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組和對照組血漿樣品中 MDA含量。

1.4.2.2 SOD測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。即通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計(jì)在550 nm處測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時(shí)，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，利用以下公式可計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組和對照組血漿樣品中的SOD活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用S PSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量資料均以表示，采用配對 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

血漿MDA和SOD的測定結(jié)果見表1。對照組和實(shí)驗(yàn)組心臟移植術(shù)后血漿MDA含量顯著升高，而SOD活性卻顯著降低，術(shù)后第1天下降最明顯。對照組與實(shí)驗(yàn)組相比，術(shù)前兩組血漿的MDA含量和SOD活性相似;術(shù)后第1天，對照組血漿MDA含量升高，并明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，而SOD活性下降，并明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05);此后，兩組血漿 MDA含量和SOD活性逐漸恢復(fù)到正常，但對照組恢復(fù)較慢，術(shù)后第9天才接近正常，實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)較快，術(shù)后第5天已恢復(fù)正常?？梢娨嫔⑸湟簩σ浦残呐K的I/R損傷確實(shí)有保護(hù)作用，這與益生注射液的離體心冷藏保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討 論

器官移植后不可避免地存在I/R，I/R損傷不僅可造成移植物原發(fā)性無功能(primary graft failure，PGF)或移植物延遲復(fù)功(delayed graft function，DGF)，而且還將導(dǎo)致移植物慢性失功(chronic graft failure，CGF)。隨著 CGF機(jī)制研究的深入，盡可能減輕I/R損傷以延緩CGF的發(fā)生、發(fā)展，從而延長移植物的存活時(shí)間逐漸成為引人注目的研究課題[2]。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物中的一種。脂質(zhì)過氧化作用及其產(chǎn)物可對細(xì)胞造成損傷，因此測定MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因此，測定SOD活力的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

現(xiàn)認(rèn)為，氧自由基的生成和鈣超載是引起I/R損傷的兩個(gè)主要因素，它們都與供體器官離體后的能量代謝障礙密切相關(guān)[3-4]。雖然低溫保存供體器官可明顯降低離體器官的能耗，但即使在低溫下細(xì)胞也不能完全停止代謝。因此，器官離體后應(yīng)盡快移植到受體是公認(rèn)的原則，另外應(yīng)用自由基清除劑和鈣離子拮抗劑來改善移植器官的功能也受到了人們的重視。目前常用的氧自由基清除劑有:SOD、別嘌呤醇、觸酶、谷胱甘肽、輔酶Q 10、維生素E和有機(jī)鍺化合物等。鈣離子拮抗劑有Diltiazem、維拉帕米和三氟拉嗪(Trifluoperazine)等[5]。

此外，傳統(tǒng)的祖國醫(yī)學(xué)在抗I/R損傷中也得到了發(fā)掘。如復(fù)方丹參、黃芪、附子和川芎嗪等，這些藥多為活血化淤、改善微循環(huán)的藥物。復(fù)方丹參為這類藥的典型代表，張昱等[6]研究了在體和離體大鼠心臟I/R模型中心肌脂質(zhì)過氧化物和鈣離子的變化，并用復(fù)方丹參進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明復(fù)方丹參對在體和離體大鼠心臟I/R均有明顯的保護(hù)作用。李幼生等[7]證實(shí)丹參對低溫保存的小腸具有保護(hù)作用。有研究認(rèn)為大鼠胰組織熱缺血45 min、再灌流60 min時(shí)，其脂質(zhì)過氧化物發(fā)生變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)丹參、SOD和輔酶Q10可減輕胰缺血再灌注損傷[5]。其可能是通過改善血液循環(huán)、減少I/R心肌的鈣聚積、保護(hù)線粒體功能，以及抑制黃嘌呤氧化酶的生成、防止脂質(zhì)過氧化等途徑來實(shí)現(xiàn)的。

益生注射液是從我國活血化淤藥物中提取出來的有效成分，本研究結(jié)果顯示，在體外實(shí)驗(yàn)中，其對靜態(tài)缺氧/再給氧損傷下培養(yǎng)的人胎兒腎毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[8];在大鼠腹主動脈移植硬化模型中，證實(shí)其可有效清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化引起的損傷[9]。在血淤型大鼠模型中，其可降低全血黏度，減少血小板聚集，抑制血小板血栓素A2(TXA2)釋放[10]。在大鼠離體心臟冷缺血損傷的實(shí)驗(yàn)研究中，其對離體心肌的冷缺血損傷有保護(hù)作用，特別是對其中的血管內(nèi)皮細(xì)胞[11]。為進(jìn)一步研究益生注射液的抗CGF作用，本研究結(jié)果顯示，與移植前相比，對照組移植后血漿MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，移植后第1天最明顯，第9天恢復(fù)正常，說明大鼠心臟移植后發(fā)生了I/R損傷，這與氧自由基含量升高而清除它的酶類下降有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組心臟移植后MDA含量也升高，SOD活性也下降，但其變化幅度較低，而且恢復(fù)快，移植后第5天恢復(fù)正常。說明益生注射液有抗脂質(zhì)過氧化和保護(hù)SOD活性的作用。

引起I/R損傷的介質(zhì)除氧自由基外，有研究表明，補(bǔ)體也介導(dǎo)I/R損傷，盡管機(jī)體存在正常的限制補(bǔ)體攻擊的內(nèi)源性途徑[12]。同樣在I/R損傷中發(fā)生的血栓形成也加重了移植物的損害，特別是血管結(jié)構(gòu):內(nèi)皮細(xì)胞活化可導(dǎo)致促凝因子增加(組織因子)，加上抗凝、抗血栓和抗補(bǔ)體調(diào)節(jié)機(jī)制的喪失[13]。以往研究證實(shí)，益生注射液中的B成分可保護(hù)體外培養(yǎng)的人胎兒腎毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧再給氧損傷，并能抑制缺氧時(shí)內(nèi)皮素-1的分泌，促進(jìn)PGI2的分泌[14]。在大鼠血淤模型中，益生注射液中的B成分可改善微循環(huán)，降低全血黏度，抑制血小板聚集[12]。此外，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以避免補(bǔ)體的激活，改善微循環(huán)，以抑制血栓形成，可能是益生注射液抗I/R損傷的另一個(gè)作用機(jī)制。

由此可見，大鼠心臟移植后，會造成移植心的缺血再灌注損傷，而益生注射液對大鼠移植心缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

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