抑制Bcl-2基因表達增強非小細胞肺癌NCI-H460細胞放射敏感性的研究

陳蜜 徐向英 許德權 趙芳宗 許慶勇 胡松柳 徐建宇

哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，黑龍江 哈爾濱 150081

*：現(xiàn)工作單位，浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院腫瘤放化療中心，浙江 寧波 315000

肺癌是我國常見的惡性腫瘤，放射治療是其主要的治療手段之一。Bcl-2基因是一種重要的抑制細胞凋亡的基因，廣泛存在于各種腫瘤細胞中。Bcl-2基因的高表達影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并使腫瘤細胞對放療和化療產(chǎn)生抵抗［1］。有證據(jù)表明，Bcl-2基因的高表達會抑制放、化療誘導的凋亡，而抑制Bcl-2基因的表達可能會增加放、化療的敏感性［2-3］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是雙鏈小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）引起特異性靶mRNA裂解而抑制其表達的過程，體內(nèi)、外的研究顯示了RNAi在癌癥基因治療方面良好的應用前景［4-6］。本實驗利用抑制Bcl-2基因表達的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）重組質粒，并將其轉染至非小細胞肺癌NCI-H460細胞中，以觀察特異性抑制Bcl-2基因表達對NCI-H460的細胞凋亡及放射敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及質粒 非小細胞肺癌NCIH460細胞株由哈爾濱醫(yī)科大學遺傳教研室提供。以pCYU6/GFP/Neo為載體的Bcl-2/shRNA重組質粒購自上海Chooseasy公司，針對Bcl-2基因的shRNA特異序列Bcl-2/shRNA：5’-GGTGAAGTCAACATGCCTGCTTCAAGAGAGCAGGCATGTTGACTTCAC-3’；無義序列Neg-shRNA：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’。

1.1.2 主要試劑及儀器 脂質體LipofectamineTM2000和G418購自美國invitrogen公司，小鼠抗人Bcl-2、β-actin單克隆抗體系SantaCruz公司產(chǎn)品，馬抗小鼠堿性磷酸酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品，直線加速器為美國Varian 2100C/D。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 NCI-H460細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%溫箱中培養(yǎng)至指數(shù)生長期，常規(guī)接種于6孔板，每孔密度為4.0×105個細胞，24 h后約80%～90%匯合時，按照LipofectamineTM2000說明書操作將重組質粒轉染至NCI-H460細胞中，轉染后24 h傳代，48 h后加入400 μg/mL的G418，篩選陽性克隆，兩周后改為200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見克隆。熒光顯微鏡下標記含綠色熒光蛋白的克隆，將其挑出后置于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞照射 采用直線加速器產(chǎn)生的6MV-X射線室溫照射細胞，劑量率為4 Gy/min，照射時將培養(yǎng)瓶的細胞面朝上，并覆1 cm厚的補償物，源皮距為100 cm。

1.2.3 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達水平分別收集轉染及未轉染的細胞，提取細胞總蛋白，以考馬斯亮藍G-250染料法測定蛋白質濃度。蛋白上樣量為60 μg，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，然后將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，用1% BSA 4 ℃封閉過夜，分別加入小鼠抗Bcl-2和β-actin單抗后溫育2 h TBST漂洗，加馬抗小鼠堿磷酶標記二抗后溫育1 h，TBST及TBS漂洗，將NC膜浸于1 mL顯色液中避光約10 min后觀察結果，實驗重復3次。

1.2.4 Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡 將轉染及未轉染的細胞各分為兩組，一組接受直線加速器4 Gy的X線照射，照射后培養(yǎng)48 h；另一組未接受X線照射作為對照組。去除培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min后，以PBS清洗細胞2次，每次3 min。避光條件下加入0.5 mL Hoechst 33258后用搖床均勻晃動，染色5 min，于熒光顯微鏡下觀察細胞。每個標本在高倍鏡下用數(shù)碼成像系統(tǒng)進行拍照，攝取相鄰不重疊的4個視野，由經(jīng)驗資深實驗技師閱片，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，并計算細胞凋亡率。

1.2.5 細胞克隆形成實驗 將對數(shù)生長期的轉染及未轉染細胞消化成單細胞懸液后，以不同數(shù)量的細胞分別接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，按由低到高的細胞密度分別接受0、2、4、6、8 Gy的X線照射，每組細胞的每個照射劑量點設3個復瓶。照射后繼續(xù)培養(yǎng)14 d，用無水乙醇固定，結晶紫染色，計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)，實驗重復3次。采用多靶單擊模型SF=1-（1-eD/Do）N繪制細胞存活曲線，并根據(jù)曲線計算D0、Dq、N和SF2值。

1.3 統(tǒng)計處理 用SAS 9.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用表示，多組均數(shù)的比較采用方差分析，組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Bcl-2/shRNA重組質粒的轉染結果NCI-H460細胞轉染質粒后，篩選獲得陽性克隆，熒光顯微鏡下可見成克隆的發(fā)綠色熒光的NCI-H460轉染后細胞，細胞呈多邊形證明轉染成功（圖1）。

圖1 轉染Bcl-2/shRNA重組質粒前后NCI-H460細胞的比較Fig.1 Comparison of NCI-H460 cells untransfected and transfected with Bcl-2/shRNA

2.2 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達水平變化 Western blot檢測結果顯示H460、H460-Neg及H460-RNAi細胞的Bcl-2/β-actin蛋白表達水平分別為0.922±0.004、0.914±0.011和0.329±0.007。前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.09，P=0.32），而H460-RNAi細胞與其余兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（t=88.54，P<0.05；t=87.45，P<0. 05）。Western blot檢測結果顯示Bcl-2/shRNA重組質粒能顯著抑制Bcl-2基因的蛋白表達水平，而Neg-shRNA質粒無明顯的抑制作用（圖2）。

2.3 細胞凋亡率變化情況 將Hoechst 33258染色后的細胞放置在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核為圓形，呈淡藍色；凋亡細胞的核由于染色質濃集而呈現(xiàn)亮藍色，核呈分葉、碎片狀等（圖3）。X射線照射前，H460細胞的凋亡率為（2.3±0.7）%，與H460細胞組及H460-Neg細胞組比較明顯增加（t=-17.99，P<0.05；t=-14.87，P<0.05）。X射線照射48 h后，H460-RNAi細胞的凋亡率高達（24.9±1.4）%，與其余兩組細胞照射后相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=-26.70，P<0.05；t=-24.95，P<0.05）；同時與未照射的H460-RNAi細胞相比，凋亡率也有明顯升高（t=-17.85，P<0.05）。結果表明，干擾質粒Bcl-2/shRNA能夠促進NCI-H460細胞凋亡，同時提高細胞對X射線誘導的細胞凋亡（表1）。

圖2 Western blot法檢測各組細胞Bcl-2蛋白表達水平Fig.2 Effect of Bcl-2 shRNA on Bcl-2 protein levels in NCI-H460 cells by Western blot

圖3 熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化Fig.3 Cell apoptosis of stable transfection with Bcl-2 shRNA by morphological observation

表1 4 Gy X射線照射前后的凋亡率比較Tab.1 Apoptosis rates at the dose of 4 Gy X-ray and without radiation[( )%]

表1 4 Gy X射線照射前后的凋亡率比較Tab.1 Apoptosis rates at the dose of 4 Gy X-ray and without radiation[( )%]

2.4 細胞克隆形成分析 根據(jù)多靶單擊數(shù)學模型所擬合的細胞存活曲線顯示H460-RNAi細胞較其余兩組明顯左移（圖4）。而所得的細胞存活參數(shù)D0、Dq、N和SF2值H460細胞組分別為1.39、1.39、2.72、0.52；H460-Neg細胞組分別為1.21、1.28、2.87、0.46；H460-RNAi細胞組分別為0.97、0.75、2.18、0.26?？梢奌460-RNAi細胞組的所有細胞存活參數(shù)均低于其余兩組，特別是D0、Dq值，而H460細胞組與H460-Neg細胞組比較差異無統(tǒng)計學意義。與對照組比較，提示H460-RNAi細胞對射線的抵抗能力低及細胞的亞致死損傷修復能力弱，即放射敏感性顯著增高。

圖4 不同細胞存活曲線Fig.4 Survival curves of different cells

3 討 論

放射治療是肺癌的主要治療手段之一，但療效仍不盡人意。影響肺癌放射治療療效的因素很多，如腫瘤的大小、乏氧細胞的多少、腫瘤細胞固有的放射敏感性等，其中腫瘤細胞固有的放射敏感性是最重要的因素，而放射敏感性是指腫瘤對射線不同程度的反應。影響腫瘤細胞固有放射敏感性的因素很多，凋亡是其中之一［7］。Bcl-2蛋白是Bcl家族中一種重要的抑制細胞凋亡蛋白，能通過線粒體凋亡途徑抑制細胞色素C從線粒體中釋放而抑制凋亡。研究表明，Bcl-2的高表達會抑制放療誘導的凋亡，而抑制Bcl-2的表達可能會增加放射敏感性［2］。最早研究的Bcl-2反義寡核苷酸已經(jīng)多次成功的應用于臨床前及臨床研究中，但反義寡核苷酸很容易降解，只能起一過性的瞬時作用，而RNAi技術可以克服這一缺點。RNAi是指在生物體細胞內(nèi)外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解所引起的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術具有高效率、可以向子代遺傳等優(yōu)點，還可同時針對多個目標基因進行研究［8］。

之前已有報道非小細胞肺癌NCI-H460細胞株的Bcl-2含量較高［9-10］，且細胞株比較適合轉染。本研究旨在觀察利用shRNA重組干擾質粒抑制NCI-H460細胞內(nèi)的Bcl-2表達水平對細胞凋亡及放射敏感性的影響。Western blot檢測結果顯示與H460細胞和H460-Neg細胞比較，H460-RNAi細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，說明Bcl-2/shRNA重組干擾質粒能有效的抑制NCI-H460細胞內(nèi)的Bcl-2基因表達。

國外有學者發(fā)現(xiàn)，在整個細胞群體中，照射后以凋亡形式死亡的細胞所占比例越大，其放射敏感性越高，這是衡量放射敏感性的重要指標。Tanaka等［11］也報道稱腫瘤細胞對射線的敏感性與放射導致的腫瘤細胞的凋亡有關。本研究通過形態(tài)學觀察細胞凋亡實驗顯示，照射前H460-RNAi細胞凋亡率較對照組明顯增加，說明抑制Bcl-2基因表達可以促進細胞凋亡；而照射后H460-RNAi細胞的凋亡率明顯高于照射后的對照組及未放療組，由此可以看出特異性抑制NCI-H460細胞的Bcl-2基因表達可以協(xié)同增加射線誘導的細胞凋亡，增強NCI-H460細胞的放射敏感性。以上觀點同Anai等［12］及Nguyen等［13］的研究一致。

細胞存活曲線是放射生物學的一個重要參數(shù)，D0為平均致死量，同一種細胞D0值的改變標志著細胞放射敏感性的變化，D0值越小則說明細胞對射線的抵抗能力越低；而Dq反映肩區(qū)大小，表示細胞亞致死損傷修復能力的大小，Dq值越小，表明細胞對亞致死損傷修復能力越弱。N為外推數(shù)和靶數(shù)，反應肩區(qū)大小，N值越小則預示對放射線越敏感。SF2為細胞受到2 Gy照射后的存活分數(shù)，SF2值越小則放射抗拒性越低。本研究中的細胞克隆形成實驗表明：H460-RNAi細胞組的D0、Dq、N和SF2值分別為0.97、0.75、2.18和0.26，均小于其余兩組細胞，特別是D0、Dq值，提示轉染Bcl-2/shRNA重組質粒后細胞放射抵抗性明顯降低，能更有效地抑制NCI-H460細胞亞致死性損傷修復，這也可能是其放射增敏作用的原因之一，國外Kim等［14］的實驗亦得出相同的結論。

綜上所述，本研究結果證實了抑制Bcl-2表達能顯著協(xié)同增強非小細胞肺癌NCI-H460細胞放療所誘導的凋亡，增強細胞的放射敏感性，為非小細胞肺癌的基因治療聯(lián)合放射治療研究提供了一些實驗基礎和理論依據(jù)。然而還有許多問題需要解決，例如，人體內(nèi)實驗是否和體外以及動物模型實驗具有相同的實驗結果，體內(nèi)細胞的微環(huán)境是否適合干擾基因的轉染及肺癌細胞是否會對其產(chǎn)生抗性，以及基因的轉染途徑及效率問題等。相信隨著基因治療和放療聯(lián)合治療策略的優(yōu)化，這些問題將會在以后的研究及工作中得到進一步的論證及改善。

［1］ Huang Z. Bcl-2 family proteins as targets for anticancer drug design［J］. Oncogene, 2000, 19(56): 6627-6631.

［2］ Tse C, Shoemaker AR, Adickes J, et al. ABT-263：A potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor［J］. Cancer Res, 2008, 68(9): 3421-3428.

［3］ Koty PP, Tyurina YY, Tyurin VA, et al. Depletion of Bcl-2 by an antisense oligonucleotide induces apoptosis accompanied by oxidation and externalization of phosphatidylserine in NCI-H226 lung carcinoma cells［J］. Mol Cell Biochem,2002, 234-235(1-2) : 125-133.

［4］ Li K, Lin SY, Brunicardi FC, et al. Use of RNA interference to target cyclin E overexpressing hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res, 2003, 63(13) : 3593-3597.

［5］ Ptasznik A, Nakata Y, Kalota A, et al. Short interfering RNA (siRNA) targeting the Lyn kinase induces apoptosis in primary，and drug- resistant，BCR- ABL1(+) leukemia cells［J］. Nat Med, 2004, 10(11): 1187-1189.

［6］ Gondi CS, Lakka SS, Dinh DH, et al. RNAi-mediated inhibition of cathepsin B and uPAR leads to decreased cell invasion, angiogenesis and tumor growth in gliomas［J］.Oncogene, 2004, 23(52): 8486- 8496.

［7］ Lei L, Story M, Legerski RJ. Cellular responses to ionizing radiation damage［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2001,49(4): 1157-1162.

［8］ Pushparaj PN, Aarthi JJ, Manikandan J, et al. siRNA, miRNA and shRNA: In vivo applications［J］. J Dent Res, 2008, 87(11): 992-1003.

［9］ Hu Y, Bebb G, Tan S, et al. Antitumor efficacy of oblimersen Bcl-2 antisense oligonucleotide alone and in combination with vinorelbine in xenograft models of human non-small cell lung cancer［J］. Clin Cancer Res, 2004, 10(22) : 7662-7670.

［10］ Danesi R, de Braud F, Fogli S, et al. Pharmacogenetics of anticancer drug sensitivity in non-small cell lung cancer［J］.Pharmacol Rev, 2003, 55(1): 57-103.

［11］ Tanaka T, Bai T, Yukawa K, et al. Reduced radiosensitivity and increased CD40 expression in cyclophosphamideresistant subclones established from human cervical squamous cell carcinoma cells［J］. Oncol Rep, 2005, 14 (4): 941-948.

［12］ Anai S, Goodison S, Shiverick K, et al. Knock-down of Bcl-2 by antisense oligodeoxynucleotides induces radiosensitization and inhibition of angiogenesis in human PC-3 prostate tumor xenografts［J］. Mol Cancer Ther, 2007, 6(1): 101-111.

［13］ Nguyen LN, Munshi A, Hobbs ML, et al. Paclitaxel restores radiation-induced apoptosis in a Bcl-2-expressing, radiationresistant lymphoma cell line［J］. Int J Radiat Oncol, 2001,49(4): 1127-1132.

［14］ Kim DW, Seo SW, Cho SK, et al. Targeting of cell survival genes using small interfering RNAs (siRNAs) enhances radiosensitivity of grade Ⅱ chondrosarcoma cells［J］. J Orthop Res, 2007, 25(6): 820-828.