RNA干擾PAR基因表達對PC3細胞生長的影響

徐曉峰 周秀敏 張征宇 葛京平 周文泉程文 位志峰 侯健全 高建平

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210002；2. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，△腫瘤科，江蘇 蘇州 215006

當前在美國前列腺癌高居男性腫瘤發(fā)病的首位［1］，目前我國前列腺癌亦呈不斷上升的趨勢。內分泌治療作為晚期前列腺癌主要的治療方法，但最終會因為前列腺癌轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆詫е轮委熓。?-3］。前列腺癌由雄激素依賴性轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆缘臋C制是目前前列腺癌研究的熱點。PAR（prostate androgen regulated）是新近發(fā)現(xiàn)的一種雄激素非依賴性前列腺癌特異性高表達的癌基因。已有研究提示PAR基因可能是與細胞的惡性轉化具有相關性［4］，但對于PAR基因高表達是否和雄激素非依賴性前列腺癌細胞的惡性表型相關，目前尚未見報道。本研究中采用RNA干擾技術抑制PAR基因在雄激素非依賴性前列腺癌細胞系PC3中的表達，觀察PC3細胞惡性表型的變化并初步研究其機制，從而更為深入地了解PAR基因的功能。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑 人前列腺癌細胞株PC3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。質粒psiRNA-hH1-neo購自InvivoGen公司。限制性內切酶BbSⅠ購自Fermentas公司?？俁NA提取試劑TRIzol和脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。M-MLV反轉錄酶購自Promega公司。高純度質粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ShRNA表達質粒的設計和構建 從GenBank經(jīng)比對獲得人PAR基因（序列號為AF115850）序列，根據(jù)shRNA的設計原則，從起始密碼子下游100 nt后選取3個符合設計特征的靶序列，分別命名為PAR-a、PAR-b和PAR-c（表1）。用BLAST軟件進行分析，未發(fā)現(xiàn)所選取的核苷酸序列與人體其他任何mRNA有同源性。

依據(jù)以上所選的序列設計3對53nt的寡核苷酸，相應分別命名為PAR1、PAR2和PAR3。每條寡核苷酸兩端為帶有BbSⅠ酶切位點的序列，兩個20 nt反向互補排列的PAR特異性序列，中間由一個5 nt的間區(qū)隔開，轉錄后可形成莖環(huán)結構（表2）。寡核苷酸由上海博亞生物技術有限公司合成。

表1 ShRNA靶向的PAR基因特異性位點Tab.1 ShRNA targeting regions of PAR gene

將合成的單鏈DNA經(jīng)退火處理獲得雙鏈結構，插入已經(jīng)用BbSⅠ酶切處理過的線性質粒psiRNA-hH1-neo中，構建獲得重組體psiRNAPAR1、psiRNA-PAR2和psiRNA-PAR3，轉化感受態(tài)細菌DH5α，挑取生長良好的克隆送上海博亞生物技術有限公司測序鑒定。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和質粒轉染 人前列腺癌細胞株PC3在含10%小牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)傳代。將PC3細胞以3×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中。當細胞生長密度達到50%～70%時，用脂質體法轉染，具體操作按試劑說明書步驟進行。實驗組中每孔加入500 μL含有6 μL LipofectamineTM2000和2 μg質粒的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)液，同時設立對照質粒組。

表2 合成的53nt寡核苷酸Tab.2 Oligo nucleotides

1.2.3 RT-PCR法檢測PAR基因的表達采用 RT-PCR 篩選有效抑制PAR基因表達的shRNA表達質粒和轉染時間：轉染48 h后，收集各組細胞，提取總RNA，以RNA反轉錄后合成的第一條cDNA鏈為模板，進行PCR擴增。PAR基因的引物序列，上游引物5’-GTCAGCAAGCACCTCAAAT-3’，下游引物5’-GAAGAAGATGGGGAAAAGG-3’；內參照β-actin基因的引物，上游引物5’-GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG-3’；下游引物5’-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3’。 PAR基因和β-actin的PCR擴增產物片段的長度分別為451 bp和202 bp。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（共30個循環(huán)）；最后72 ℃ 延伸10 min。擴增后的產物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gelworks 1D Advanced v4.01軟件進行條帶灰度分析。

1.2.4 測定細胞生長曲線 取對數(shù)生長期細胞，0.25%的胰酶消化后，轉染前24 h以5×104個/mL的細胞密度接種于24孔板中。轉染后，每天取3個孔的細胞計數(shù)，取其平均值，共7 d，繪制成生長曲線。

1.2.5 軟瓊脂克隆形成實驗 將約50 ℃、含0.6%瓊脂、10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL灌入直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，置于室溫待其凝固。將2 mL的50 ℃、含200個細胞、0.3%瓊脂和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液再均勻灌入入已鋪有底層培養(yǎng)基的60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)15 d，然后在光學顯微鏡下計數(shù)含50個以上細胞的克隆，計算克隆形成率。每實驗組設3個平行樣本，實驗重復2次，計算平均值。

1.2.6 流式細胞儀分析細胞調亡和細胞周期 用篩選獲得的抑制效應最明顯的shRNA表達質粒psiRNA-PAR1轉染PC3細胞，轉染后24和48 h后收集細胞，然后用PBS洗滌細胞2次，再以500 μL PBS重懸細胞，加入-20 ℃預冷的85%乙醇溶液，4 ℃固定過夜。再用PBS洗滌細胞2次，加入100 μL PC 緩沖液（phosphate-citric acid buffer）（0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L citric acid按192∶8的體積比混勻，pH值為7.8）室溫條件下避光處理20 min。再以PBS洗滌1次，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液500 μL（含10 μg/mL的PI和100 μg/mL的RNase A），避光，室溫條件下處理30 min后上機，用流式細胞儀進行細胞調亡和細胞周期的檢測。

1.3 統(tǒng)計處理 所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS 11.0行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 shRNA表達質粒的構建 成功構建獲得shRNA表達質粒，經(jīng)測序證實，針對PAR基因的3個特異性靶序列的寡核苷酸均成功插入psiRNA-hH1-neo質粒，和設計序列完全一致。

2.2 轉染shRNA表達質粒對PC3細胞PAR mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結果顯示， PC3細胞中psiRNA-PAR1、psiRNAPAR2和psiRNA-PAR3對PAR mRNA的表達均有一定的抑制作用，其中以psiRNA-PAR1抑制效果最好，這3種表達質粒和對照質粒組相比平均抑制率分別為（81.18±1.68）%、（47.65±1.97）%和（5.25±0.59）%，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01，圖1）。

在轉染48 h后，psiRNA-PAR1對PAR mRNA表達的抑制率達最高峰，為（81.18±1.68）%；而24和72 h時的抑制率分別為（28.96±3.95）%和（68.67±1.00）%，經(jīng)比對，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01，圖2）。

2.3 轉染shRNA表達質粒對PC3細胞生長速率的影響 根據(jù)細胞計數(shù)結果繪制細胞生長曲線，由生長曲線結果提示：轉染psiRNA-PAR1的細胞生長速率減慢最明顯，相同時間內細胞增長數(shù)最少；轉染psiRNA-PAR2的細胞次之；轉染psiRNA-PAR3的細胞生長減慢變化最小，這與RT-PCR檢測結果一致（圖3）。

2.4 轉染shRNA表達質粒對PC3細胞克隆形成能力的影響 軟瓊脂克隆檢測結果顯示：轉染了質粒psiRNA-PAR1、psiRNA-PAR2和psiRNA-PAR3的PC3細胞的克隆形成率分別為0、2%和48%，與轉染空載體組的62%和空白對照組（未轉染質粒）的68%相比較，明顯降低（P<0.05），尤其是psiRNA-PAR1組的細胞克隆形成能力幾乎喪失。

圖3 轉染shRNA后PC3細胞的生長情況Fig.3 Growth of PC3 cells after transfected with shRNA

2.5 細胞調亡和細胞周期變化 FCM法檢測結果提示，shRNA 轉染PC3細胞24和48h時，對照組處于G2/M期的細胞分別為（21.39±1.39）%和（23.79±3.16）%，凋亡率分別為（0.30±0.04）%和（1.49±0.13）%；而 psiRNA-PAR1組處于G2/M期的細胞分別為（39.32±1.56）%和（29.95±3.25）%，凋亡率分別為（12.16±1.18）%和（20.61±2.73）%，與對照組相比，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01，表3，圖4），說明轉染psiRNAPAR1對PC3細胞有明顯的細胞周期阻滯作用，使細胞阻滯在G2/M期，并誘導PC3細胞發(fā)生凋亡。

表3 psiRNA-PAR1轉染對PC3細胞周期和凋亡的影響Tab.3 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells( )

表3 psiRNA-PAR1轉染對PC3細胞周期和凋亡的影響Tab.3 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells( )

?

圖4 psiRNA-PAR1轉染對PC3細胞周期和細胞凋亡的影響Fig.4 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells

3 討 論

臨床研究結果顯示，在晚期前列腺癌內分泌治療過程中癌細胞出現(xiàn)雄激素非依賴性是治療失敗的主要原因［8］。近年來，人們在分子水平對雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)病機制和治療進行了大量的研究，不斷尋找新的致癌基因并作為其潛在的分子靶點［9-10］，而其中具有前列腺癌組織特異性的致癌基因更有研究價值［4-5］。

新近發(fā)現(xiàn)的在前列腺癌中表達異常的PAR基因位于人1號染色體上，片段長度為1 038 bp，編碼146個氨基酸，其在正常的前列腺組織和癌組織中均有表達，但大約67%標本中，癌組織中有更高的表達；PAR在LNCaP、DU145、PC3和LNCaP-OM等前列腺癌細胞系中的表達也比正常的前列腺上皮細胞要高；而在雄激素非依賴性細胞系DU145、PC3和LNCaPOM中的表達明顯高于雄激素依賴性細胞系LNCaP。雄激素可以使雄激素依賴性細胞系的PAR表達下調，而對雄激素非依賴性細胞系的PAR表達則無抑制作用［6］。Platica等［7］將PAR cDNA重組質粒轉染成纖維細胞NIH3T3，使其獲得惡性表型，但抑制PAR基因在雄激素非依賴性前列腺癌細胞系中的表達是否會使其惡性表型逆轉，目前尚無相關研究報道。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術的作用機制是：以同源互補序列的mRNA為靶目標，通過活化的21～23 nt的小片段干擾RNA（siRNA），降解特定的mRNA，使目的基因表達下調。siRNA作用的高效性、特異性和 穩(wěn)定性均優(yōu)于反義核酸和核酶等反義技術［11］。本實驗采用了psiRNA-hH1-neo質粒系統(tǒng)，成功構建了針對PAR基因3個不同位點的siRNA表達質粒并轉染PC3細胞，通過抑制PAR基因的表達研究其功能。轉染shRNA表達質粒的PC3細胞系與對照組相比，PAR基因的mRNA表達明顯下調，提示RNAi技術可以有效抑制PAR的表達，有望作為前列腺癌基因治療的有效手段。本研究利用細胞計數(shù)、軟瓊脂克隆形成實驗表明PAR表達下調可明顯抑制PC3細胞惡性增殖。為探討細胞生長抑制的機制，進一步利用流式細胞術檢測，發(fā)現(xiàn)PAR基因的mRNA表達下調能夠明顯引起PC3細胞阻滯于G2/M期，凋亡增加。G2/M期檢查點是細胞存活和死亡的重要決定點，細胞經(jīng)過此點即進入分裂期［12-13］。下調PAR基因的表達可使腫瘤細胞生長變慢，其主要機制可能是誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯和凋亡。這一結果提示PAR基因可能參與前列腺癌的惡性轉化，PAR基因可能是一個新的與雄激素非依賴性前列腺癌細胞惡性增殖密切相關的癌基因，有望作為今后前列腺癌基因治療的有效靶點之一。

［1］ Greenlee RT, Hill-Harmon MB, Murray T, et al. Cancer statistics, 2001［J］. CA Cancer J Clin, 2001, 51(1): 15-36.

［2］ Hegeman RB, Liu G, Wilding G, et al. Newer therapies in advanced prostate cancer［J］. Clin Prostate Cancer, 2004,3(3): 150-156.

［3］ Miyamoto H, Messing EM, Chang C. Androgen deprivation therapy for prostate cancer: current status and future prospects［J］. Prostate, 2004, 61(4): 332-353.

［4］ Shi XB, Gumerlock PH, de Vere White RW. Molecular biology of prostate cancer［J］. World J Urol, 1996, 14(5): 318-328.

［5］ Huncharek M, Muscat J. Genetic characteristics of prostate cancer［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 1995, 4(6):581-687.

［6］ Platica O, Chen S, Ivan E, et al. PAR, a novel androgen regulated gene, ubiquitously expressed in normal and malignant cells［J］. Int J Oncol, 2000, 16(5): 1055-1061.

［7］ Platica M, Ivan E, Ionescu A, et al. Transformation of NIH3T3 cells by enhanced PAR expression［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314(3): 891-896.

［8］ Bonaccorsi L, Muratori M, Carloni V, et al. Androgen receptor and prostate cancer invasion［J］. Int J Androl, 2003; 26(1):21-25.

［9］ Horvath LG, Henshall SM, Kench JG, et al. Loss of BMP2,Smad8 and Smad4 expression in prostate cancer progression［J］. Prostate, 2004, 59(3): 234-242.

［10］ 李燕，周志毅，石群立. 前列腺癌的分子病理學研究［J］. 醫(yī)學研究生學報, 2007, 20(10): 1088-1093.

［11］ Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.Science, 2002, 296: 550-553.

［12］ Labazi M, Phillips AC. Oncogenes as regulators of apoptosis［J］. Essays Biochem, 2003, 39: 89-104.

［13］ Vermeulen K, Berneman ZN, Van Bockstaele DR. Cell cycle and apoptosis［J］. Cell Prolif, 2003, 36(3): 165-175.