大白菜抗軟腐病性狀的SRAP標(biāo)記分析

徐瑩瑩，崔崇士，屈淑平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

大白菜（Brassica campestris L.ssp.pekinensis）是二年生的十字花科蕓薹屬蔬菜作物，原產(chǎn)于中國(guó)，是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物之一，在蔬菜周年供應(yīng)中占有重要地位。軟腐病是大白菜生產(chǎn)中的細(xì)菌性病害，因其危害性也被稱(chēng)為大白菜三大病害之一。該病害是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種（Erwinia.carotovora.subsp.carotovora Ecc.）引起的[1]。該病害在前期干旱、后期多雨或灌水不當(dāng)情況下，很容易在生產(chǎn)中大面積流行，從而造成嚴(yán)重減產(chǎn)，該病是影響大白菜優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素[2]。由于大白菜種質(zhì)資源中缺少抗源材料，以及對(duì)植物抗病機(jī)制認(rèn)識(shí)的匱乏，軟腐病抗病育種一直是大白菜育種中的重大難題。

近年來(lái)，基因組研究的迅速發(fā)展為許多農(nóng)作物提供了大量分子標(biāo)記技術(shù)和多種多樣的檢測(cè)手段,使分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection,MAS）應(yīng)用于作物遺傳改良成為現(xiàn)實(shí)，并取得了一系列成就，MAS是通過(guò)利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行早期、間接、準(zhǔn)確選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)[3]。SRAP分子標(biāo)記是MAS的一種方法，它是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)[4]，主要針對(duì)基因外顯子里GC含量豐富，而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，擴(kuò)增譜帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較廣[5-6]，本研究將SRAP應(yīng)用于大白菜抗軟腐病性狀的分子標(biāo)記輔助選擇中，為建立大白菜軟腐病抗性育種分子標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)和開(kāi)展抗軟腐病分子生物技術(shù)育種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以高抗軟腐病的大白菜高代自交系A(chǔ)32-2和感病自交系A(chǔ)19-2雜交后代構(gòu)建F2代分離群體，共計(jì)225個(gè)單株。2007年5月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站將親本、F1、F2代種子種于防蟲(chóng)溫室內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鑒定

親本材料及F2代分離群體采用史國(guó)立等的苗期抗性鑒定方法[7]，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至7～8片真葉時(shí)進(jìn)行人工接種，接種時(shí)先用鋒利的刀片在葉柄基部輕輕劃4道小傷口，接種濃度為1013cfu·mL-1，然后用注射器慢慢地把0.01 mL菌液注入到傷口表面，形成懸浮滴。發(fā)病溫度28℃，相對(duì)濕度100%，接種后7 d調(diào)查病情。

1.2.2 DNA的提取和SRAP分析

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試驗(yàn)分析的SRAP引物Table 1 SRAP primers for analysis

采用CTAB法[8]提取親本及每個(gè)單株的DNA，參照張書(shū)芬等使用的引物[9]，從中選出10條正向引物和17條反向引物（見(jiàn)表1），正向引物和反向引物兩兩搭配成170個(gè)引物組合，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增條件為：94℃變性3 min；94℃變性30 s，35℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，50℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。SRAP-PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上采用恒功率80 W電泳2 h，電泳儀采用Bio-rad垂直電泳儀，加樣量為7.5 μL。然后進(jìn)行銀染，掃描或照相保存。

1.2.3 連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

統(tǒng)計(jì)在親本之間產(chǎn)生的多態(tài)性并且在F2群體中有分離的條帶。與親本A32-2帶型相同者賦值為1，與親本A19-2帶型相同者賦值為0，由于各種原因造成的數(shù)據(jù)不清楚或數(shù)據(jù)缺失者賦值為“-”。采用Mapmaker3.0進(jìn)行分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距（cM），以最大圖距50 cM作為劃分連鎖群和排列Markers的基準(zhǔn)距離。運(yùn)用軟件Windows QTL Cartographer V2.5和復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)所考察的性狀進(jìn)行全基因組掃描，掃描區(qū)間為1 cM，以LOD≥3.0為閾值，檢測(cè)軟腐病性狀相關(guān) QTL的存在（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟腐病抗性表型及其遺傳特點(diǎn)

結(jié)果表明，本研究所選抗性材料對(duì)軟腐病具較強(qiáng)抗性。對(duì)抗病親本A32-2、感病親本A19-2以及兩者雜交所產(chǎn)生的F1代接種軟腐病菌后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)親本和F1代的平均病情指數(shù)分別為17.54，82.86和23.54。F1代的平均病情指數(shù)低于雙親病情指數(shù)的平均值，其抗性介于雙親之間，趨向抗病親本。

根據(jù)F2代病情分級(jí)和各病級(jí)的株數(shù)利用SAS 8.2 univariate程序進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)2代單株人工接種軟腐病菌后癥狀表現(xiàn)為連續(xù)分布，呈現(xiàn)出數(shù)量遺傳學(xué)特征，其偏度為0.1836，小于0.5，峰度為0.1358，符合正態(tài)分布，適于進(jìn)行QTL定位。

2.2 SRAP標(biāo)記多態(tài)性引物分析

用父母本對(duì)170對(duì)SRAP正、反引物組合進(jìn)行篩選，得到24對(duì)條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合，檢測(cè)到139個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶差異很大，最多的11條，少的只有3條，平均每對(duì)引物5.8條。在139個(gè)SRAP標(biāo)記中，來(lái)自A32-2的標(biāo)記有79個(gè)，占56.8%，來(lái)自A19-2的標(biāo)記有60個(gè)，占43.2%，比例大致持平，基本符合1：1的分離比。群體在總體上未出現(xiàn)嚴(yán)重的偏分離，為理想的作圖群體。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 24對(duì)SRAP引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)Table 2 Numbers of polymorphic bands generated using 24 SRAP primer pairs

2.3 大白菜SRAP分子連鎖圖譜的構(gòu)建

以225個(gè)F2代單株為作圖群體，共獲得139個(gè)SRAP多態(tài)標(biāo)記，用Mapmaker/EXP3.0構(gòu)建遺傳連鎖圖。共獲得10個(gè)連鎖群（見(jiàn)圖1），編號(hào)為L(zhǎng)G1到LG10，包含103個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)1 223.6 cM，每個(gè)連鎖群有4～25個(gè)標(biāo)記，最長(zhǎng)的連鎖群為348.0 cM，最短的連鎖群為40.5 cM。標(biāo)記間最大間距為33.1 cM，最小間距為2.2 cM，標(biāo)記間平均間距11.9 cM。

圖1 連鎖圖譜及QTL分布Fig.1 Linkage map and distribution of QTL for resistant to the soft rot of Chinese cabbage

表3 大白菜F2群體軟腐病抗性復(fù)合區(qū)間作圖定位QTLTable 3 Genetic parameters estimated by interval mapping of the QTLs identified in the F2population from cross A32-2×A19-2

2.4 大白菜抗軟腐病的QTL分析

用Windows QTL Cartographer V2.5軟件進(jìn)行分析，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，LOD值大于3.0作為QTL存在的閾值。通過(guò)對(duì)抗軟腐性狀QTL分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同的QTL位點(diǎn)（見(jiàn)表1）。4個(gè)QTL位點(diǎn)分別位于LG2、LG6和LG7連鎖群上，如圖1所示，暫時(shí)命名為 QE1、QE2、QE3和 QE4。QE1位于M06E1404和M06E1405之間，與最近的標(biāo)記M06E1404的距離為12.3 cM，加性效應(yīng)為9.17，可以解釋表型變異的14.23%；QE2位于M02E1407和M02E1409之間，與最近的標(biāo)記M02E1407的距離為4.7 cM。加性效應(yīng)為10.56，可解釋表型變異為22.73%；QE3位于M02E0301和M02E0302之間，與最近的標(biāo)記M02E0301的距離為2.9 cM，加性效應(yīng)為5.24，可解釋表型變異為9.33%；QE4位于M05E0607和M09E0202之間，與最近的標(biāo)記M05E0607的距離為16.4 cM，加性效應(yīng)為4.35，可解釋的表型變異為8.52%；當(dāng)QE1、QE2、QE3和QE4表現(xiàn)親本A32-2的基因型時(shí)，分別能降低病情指數(shù)9.17%、10.56%、5.24%、4.35%。由此推斷大白菜抗軟腐病抗性為不完全顯性基因控制，支持?jǐn)?shù)量性狀基因控制軟腐病抗性的觀點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

本研究選用大白菜高抗軟腐病A32-2自交系和高感軟腐病A19-2自交系為親本，用24對(duì)SRAP引物對(duì)兩親本產(chǎn)生的F2群體進(jìn)行SRAP分析，共檢測(cè)到139個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶差異很大，最多的11條，少的只有3條，平均每對(duì)引物5.8條，其多態(tài)性產(chǎn)生的頻率與已報(bào)道的大致相同[11]，可以滿足遺傳圖譜的構(gòu)建。

目前，關(guān)于大白菜軟腐病的遺傳規(guī)律和抗性機(jī)制的報(bào)道很少，遺傳規(guī)律與抗病機(jī)制目前還不是很明確。鄒學(xué)校等用一個(gè)參數(shù)和二個(gè)參數(shù)的直線回歸法研究了大白菜不同生育期軟腐病嚴(yán)重度的遺傳穩(wěn)定性[12]。結(jié)果表明，特別抗病和特別感病的雜交種穩(wěn)定性較好，中間類(lèi)型的雜種穩(wěn)定性較差，一般雜種抗性穩(wěn)定性好的組合，其抗性雜種優(yōu)勢(shì)的穩(wěn)定性也較好，但也有例外情況。估算不同生育期軟腐病抗性遺傳參數(shù)表明，結(jié)球始、后期抗性表現(xiàn)較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，遺傳力高，選擇的遺傳進(jìn)度大，但其抗性雜種優(yōu)勢(shì)和遺傳力高低與外界環(huán)境有關(guān)。韓香婷研究表明，大白菜對(duì)軟腐病的抗性為數(shù)量性狀，受多基因控制[13]。牟晉華等以抗、感軟腐病的大白菜材料為親本，以其F2代分離群體為試材，研究其遺傳規(guī)律[14]，表明該群體對(duì)軟腐病的抗性受單基因隱性控制，并采用AFLP分析技術(shù)結(jié)合BSA分組法，以E2M3引物組合篩選出一個(gè)150 bp的與感病基因連鎖的標(biāo)記。本研究結(jié)合大白菜軟腐病苗期接種鑒定及SRAP標(biāo)記分析共檢測(cè)到4個(gè)QTL位點(diǎn)，由此推斷大白菜軟腐病為不完全顯性，受多對(duì)基因控制，支持?jǐn)?shù)量性狀基因控制軟腐病抗性的觀點(diǎn)，與韓香婷等的研究結(jié)果一致[13]。大白菜軟腐病遺傳規(guī)律研究存在的分歧，可能是由于病原材料、抗病親本、接種程度、接種苗齡以及環(huán)境條件等差異造成的。

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