盾葉薯蕷組培快繁技術(shù)研究

周雄祥，肖建洲

（1.湖北省農(nóng)業(yè)廳蔬菜辦公室，湖北武漢，430070；2.長江蔬菜雜志社）

盾葉薯蕷（Dioscorea ZingiberensisC.H.Wright）又名黃姜，為薯蕷科薯蕷屬單子葉植物，是迄今發(fā)現(xiàn)的能大量合成皂素的植物藥源之一，被譽為“藥用黃金”[1]。盾葉薯蕷主要以塊莖進行無性繁殖，其繁殖系數(shù)低，且種性退化嚴重，塊莖中皂素含量也極不穩(wěn)定，優(yōu)質(zhì)種苗的嚴重不足在很大程度上制約了盾葉薯蕷規(guī)?；a(chǎn)[2]。因此，選擇和培育皂素含量高的盾葉薯蕷優(yōu)良品種，并大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量種苗，是解決當前薯蕷生產(chǎn)問題的有效途徑。本研究采用組織培養(yǎng)技術(shù)，對盾葉薯蕷的快速繁殖進行了研究，期望為生產(chǎn)提供大量優(yōu)質(zhì)種苗，促進盾葉薯蕷的規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為盾葉薯蕷二年生根狀莖，以生長約4個月的植株的幼嫩莖尖、嫩葉和幼嫩果莢為組織培養(yǎng)起始材料。

1.2 外植體制備

以幼嫩莖尖、葉和果莢為外植體。外植體置于自來水下沖洗30 min后，轉(zhuǎn)入加有1滴吐溫20的0.1%升汞溶液中消毒 6～8 min，中途振蕩 2～3 次，然后用無菌水漂洗4次。消毒后的外植體置于無菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀將其切割成適當大小（葉片和果莢約 0.5 cm×0.5 cm，莖段長約 0.3 cm），并接種于培養(yǎng)基上。

1.3 試驗方法

整個試驗所用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[3]基本配方，并附加不同濃度的生長素和細胞分裂素。試驗共設(shè)4種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，4種芽分化培養(yǎng)基和3種芽增殖培養(yǎng)基，以不加任何激素的MS培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)基的具體配方見表1。

所有培養(yǎng)基均添加0.2%活性炭，30 g/L蔗糖和0.7 g/L瓊脂，pH值在滅菌前調(diào)至5.8。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)均在高壓滅菌前加入，高壓滅菌條件為121℃保持20 min。接種后外植體置于1 500 lx光照強度下誘導愈傷組織，于光照強度為4 000 lx、光照時間16 h/d條件下誘導芽分化和增殖。培養(yǎng)過程中溫度保持在（25±1）℃。

表1 試驗所用的培養(yǎng)基

外植體或愈傷組織按不同處理接種，每個處理至少有20個外植體或愈傷組織塊，每處理重復3次。定期統(tǒng)計出愈率、出芽率和增殖率等指標。百分比轉(zhuǎn)化為正弦值后利用鄧肯氏新復極差法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對愈傷組織誘導的影響

外植體接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上1周后，幾乎所有的莖段切口處都出現(xiàn)膨大，呈啞鈴狀；幼嫩果莢橫切面接觸到培養(yǎng)基部分出現(xiàn)膨大；嫩葉四周切口處出現(xiàn)不同程度的腫脹，整個葉片增厚并隆起呈瓦片狀。約30 d后，各類外植體開始愈傷組織化，莖尖首先出現(xiàn)愈傷組織（30 d），果莢和嫩葉則稍晚（分別為45 d和40 d）。不同類型外植體誘導愈傷組織的難易程度不一致（表2）。果莢出愈率最高（54.4%），莖尖次之（51.3%），但與果莢差異不顯著，嫩葉的出愈率最低（12.8%）。綜合考慮以上因素，莖尖外植體出愈率高，不易污染，且愈傷組織誘導時間短，是組織培養(yǎng)較理想的外植體材料。

2.2 不同激素組合對愈傷組織誘導的影響

試驗所設(shè)計的4種愈傷組織誘導培養(yǎng)基均能誘導愈傷組織產(chǎn)生，但不同培養(yǎng)基的出愈率和愈傷組織狀態(tài)有所不同。由表3可知，愈傷組織誘導率最高的是 C 培養(yǎng)基（69.8%），D 次之（56.8%），A 和B培養(yǎng)基效果不理想 （出愈率分別為 32.9%和43.1%）。由此可知，盾葉薯蕷對生長素種類有一定的選擇性，NAA的效果比2，4-D好。從愈傷組織的狀態(tài)來看，生長素為NAA的培養(yǎng)基上愈傷組織呈綠色或淺綠色，結(jié)構(gòu)緊湊，而添加2，4-D的培養(yǎng)基則容易促使愈傷組織崩裂，其愈傷組織多為淡黃色半透明或水漬狀，不利于以后分化成苗。結(jié)構(gòu)緊密型愈傷組織在C和D培養(yǎng)基上能穩(wěn)定增殖并保持其狀態(tài)，而疏松型愈傷組織轉(zhuǎn)入到C或D培養(yǎng)基繼代3～4次方可轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)緊密型愈傷組織。

2.3 不同激素組合對愈傷組織芽分化的影響

結(jié)構(gòu)緊密型愈傷組織轉(zhuǎn)入到芽分化培養(yǎng)基上1周后開始出現(xiàn)芽點，芽周圍有白色的鱗片包被，3周后分化出芽。表4顯示了培養(yǎng)3周后的出芽情況。H培養(yǎng)基上最有利于愈傷組織分化，出芽率最高（90.9%），但平均出芽數(shù)僅有 3.2個。 G 培養(yǎng)基也能有效的促使愈傷組織分化，其出芽率（86.2%）僅次于G培養(yǎng)基，平均芽數(shù)最多（6.8個）。F培養(yǎng)基出芽率和平均出芽數(shù)均不如G，H培養(yǎng)基。E培養(yǎng)基出芽率最低（16.3%），平均出芽數(shù)稍高（5.2 個）。 試驗中觀察發(fā)現(xiàn)，盡管E，G培養(yǎng)基（僅含有BA或KT）平均出芽數(shù)較高，但這些芽大多為細小的叢生芽，難以復壯、成活。而F，H培養(yǎng)基（含有NAA和BA或KT）平均出芽數(shù)少，但芽生長健壯，容易成活。綜合分析可知，H培養(yǎng)基的芽分化效果最好。在H培養(yǎng)基上，不定芽再經(jīng)1～2周即可成為具有數(shù)個結(jié)節(jié)的植株。

表2 外植體類型對愈傷組織誘導的影響

表3 不同激素組合對愈傷組織誘導的影響

表4 不同激素組合對愈傷分化成芽的影響

表5 不同激素組合對腋芽增殖的影響

2.4 不同激素組合對腋芽增殖的影響

盾葉薯蕷具有結(jié)節(jié)，因而可通過產(chǎn)生腋芽進行增殖。將幼嫩植株切成數(shù)個莖段 （每個莖段1個節(jié)），接種在芽增殖培養(yǎng)基上1周后，腋芽開始萌動并伸長，每個節(jié)段可發(fā)生數(shù)個不定芽。接種3周后的統(tǒng)計結(jié)果見表5。K培養(yǎng)基促使腋芽增生的效果最好，增殖率達 77.1%，單節(jié)平均芽數(shù)達 6.2 個；I，J培養(yǎng)基也能促使腋芽增殖，增殖率和單節(jié)平均數(shù)稍低，兩者之間差異不顯著。試驗中發(fā)現(xiàn)，盡管K培養(yǎng)基的增殖效果最好，但節(jié)間容易產(chǎn)生瘦小的叢生芽，生長速度慢；而I，J培養(yǎng)基盡管單節(jié)出芽數(shù)少，但腋芽生長健壯，生長速度快，容易成活。因而，從再生苗的質(zhì)量角度考慮，I，J培養(yǎng)基適宜于腋芽增殖。

2.5 再生苗生根

從增殖培養(yǎng)基上切取長1～2 cm的腋芽，接種在不加任何激素的MS培養(yǎng)基上，1周后芽基部開始出現(xiàn)白根。經(jīng)統(tǒng)計，腋芽的生根率幾乎為100%。

3 小結(jié)與討論

離體條件下，盾葉薯蕷可以通過愈傷組織形成再生植株，也可以通過腋芽增殖而產(chǎn)生再生植株，這兩種器官發(fā)生方式均可以實現(xiàn)盾葉薯蕷的快速繁殖[4]。從現(xiàn)有的報道來看，大多試驗均以盾葉薯蕷莖尖為起始材料來建立離體培養(yǎng)，本試驗也證明，含有大量分生組織的莖尖外植體出愈率高且不易污染，是較理想的外植體。試驗還發(fā)現(xiàn)，葉片和幼嫩果莢也能誘導出愈傷組織，葉片的出愈率要低于莖尖，但幼嫩果莢的出愈率卻要高于莖尖，這可能是與其性器官中含有大量胚性組織有關(guān)。

2，4-D和NAA與BA組合均能誘導出愈傷組織，雖然2，4-D能迅速刺激外植體愈傷組織分化，但愈傷組織大多半透明或水漬狀，不易分化成苗，偶爾還可以見到胚狀體產(chǎn)生。NAA則可誘導產(chǎn)生結(jié)構(gòu)緊湊的愈傷組織，并能支持其穩(wěn)定生長與分化。許多組織培養(yǎng)試驗表明，2，4-D可使細胞或組織通過胚胎發(fā)生途徑產(chǎn)生植株，而NAA一般只能使細胞或組織通過器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株[5]，本試驗也證實此觀點。

在添加較高濃度細胞分裂素的培養(yǎng)基上，愈傷組織能分化成苗，但單獨使用細胞分裂素容易導致叢生芽產(chǎn)生。本試驗觀察到，高濃度細胞分裂素配合低濃度生長素得到較高的芽分化率，這一結(jié)果也支持了Skoog和Miller提出的 “激素平衡”學說[6]。盡管BA和KT均能促使不定芽的分化與增殖，但添加KT的培養(yǎng)基上的芽分化率和平均出芽數(shù)比添加BA的培養(yǎng)基上要高 （盡管KT誘導的芽大多為叢生芽），說明KT的細胞分裂素活性比BA強。

盾葉薯蕷因有腋芽分生組織而能通過腋芽增殖而實現(xiàn)離體快繁，高濃度的BA與低濃度的NAA配合（BA/NAA≥2），可以支持盾葉薯蕷莖段快速增殖。一般來說，通過腋芽增殖的擴繁方式要優(yōu)于通過愈傷組織的繁殖方式，因為愈傷組織誘導和增殖都是細胞快速分裂的結(jié)果，不可避免的造成體細胞無性系變異，而腋芽增殖則可大大降低這種變異程度，能保證其繁殖群體較高，性狀一致性。因此，盾葉薯蕷的快速繁殖可直接通過莖段外植體（或愈傷組織初代培養(yǎng)產(chǎn)生的植株）誘導腋芽增殖，以保證獲得高質(zhì)量的組培種苗。

[1]趙猛，朱洪梅.盾葉薯蕷種質(zhì)資源研究進展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2009（1）：71-74.

[2]張友德，蘆煜照.黃姜有性繁殖研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，1999，18（1）：8-10.

[3]Classic M T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture[J].Physiol Plant,1962,15:473-497.

[4]蔣玉寶，于元杰.薯蕷植物組織培養(yǎng)的研究進展[J].生物技術(shù)，2006，16（14）：93-96.

[5]Murashige T.Plant propagation through tissue cultures[J].Ann Rev Plant Physiol,1994，25:135-166.

[6]Skoog F,Miller C O.Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue culture in vitro [J].Symp Soc Exp Biol,1957,11:118-131.