秋水仙素誘導(dǎo)離體培養(yǎng)越橘多倍體研究

李曉艷，張志東，李亞?wèn)|，吳 林，劉海廣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

多倍體育種是獲得新品種的主要途徑之一，利用秋水仙素處理植株是獲得多倍體的有效方法。多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)最初多在田間進(jìn)行，但由于變異細(xì)胞往往因?qū)娱g取代而消失。采用試管苗處理可以使獲得的誘變嵌合體在短時(shí)間內(nèi)快速大量繼代和分離。越橘屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），是一類(lèi)富含營(yíng)養(yǎng)的小漿果。關(guān)于秋水仙素誘導(dǎo)越橘多倍體研究目前在國(guó)內(nèi)未有相關(guān)報(bào)道，國(guó)外的研究對(duì)誘變材料的鑒定僅限于根尖染色體計(jì)數(shù)和形態(tài)方面的觀察[1-2]。本試驗(yàn)通過(guò)秋水仙素處理對(duì)越橘試管苗進(jìn)行誘導(dǎo)，并對(duì)變異株系進(jìn)行了篩選。越橘多倍體材料的獲得將為培育越橘多倍體新品種奠定基礎(chǔ)，為今后越橘品種選育提供親本材料，對(duì)指導(dǎo)果樹(shù)倍性育種具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

采用3個(gè)越橘品種的組培苗：美登（Blomidon）、達(dá)柔（Darrow）、埃利奧特（Elliott）。以上3個(gè)品種為已知二倍體（2n=2x=24）[3-5]，均來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小漿果研究所。

培養(yǎng)基為改良的WPM基本培養(yǎng)基，添加玉米素（Zeatin，ZT） 0.7 mg·L-1，蔗糖 3%，瓊脂 0.7%，pH 5.4。培養(yǎng)基在121℃，1.1 kg·cm-2壓力下高溫滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1 藥劑培養(yǎng)基法

將生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌試管苗剪去頂端，促進(jìn)腋芽萌發(fā)，4～6 d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段，轉(zhuǎn)接到含有秋水仙素的WPM+ZT 2.0 mg·L-1培養(yǎng)基中。秋水仙素濃度設(shè)5個(gè)水平：0%（對(duì)照）、0.001%、0.002%、0.003%、0.005%。培養(yǎng)30 d左右，待處理的腋芽萌動(dòng)抽莖長(zhǎng)至1～2 cm后繼代到不含秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基中。

1.2.2 浸漬法

將生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌試管苗剪去頂端，促進(jìn)腋芽萌發(fā)，4～6 d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段，浸泡在經(jīng)高壓滅菌的0（對(duì)照）、0.05%、0.1%、0.2%秋水仙素水溶液中，然后放在搖床上以100 r·min-1震蕩，處理時(shí)間分別為6、12和24 h。在超凈工作臺(tái)上將材料從秋水仙素水溶液中取出，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將單芽莖段轉(zhuǎn)接到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中。待處理的腋芽萌動(dòng)抽莖長(zhǎng)至1～2 cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中。

1.3 變異材料檢測(cè)

1.3.1 鏡檢

采用根尖常規(guī)壓片進(jìn)行染色體的觀察，染色液選用鐵礬-蘇木精[6]。待越橘試管苗在生根培養(yǎng)基（1/2WPM+IBA 0.2 mg·L-1+活性炭 1 g·L-1）中的根長(zhǎng)到0.5～1.0 cm左右進(jìn)行壓片鏡檢。選擇染色體分散好的細(xì)胞在OLYMPUS顯微鏡下觀察并拍照。每種材料觀察30個(gè)以上的中期分裂細(xì)胞。

1.3.2 流式細(xì)胞光度法鑒定

參照Dolezel等利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色體的方法[7]。每個(gè)品種重復(fù)3次，以達(dá)柔為對(duì)照。采用美國(guó)B-D公司的B-D FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定、分析細(xì)胞倍性。

存活率（%）=（成活個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)）×100%

變異率（%）=（變異個(gè)數(shù)/成活個(gè)數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑培養(yǎng)基法對(duì)越橘試管苗莖段誘導(dǎo)多倍體的影響

在本研究中3個(gè)供試越橘品種表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即在不添加秋水仙素的培養(yǎng)基中存活率都在90%以上，而只加入0.001%的秋水仙素存活率就大副下降，埃利奧特只加濃度為0.001%秋水仙素存活率由對(duì)照95.7%下降到30.0%，但沒(méi)有檢測(cè)出染色體加倍的細(xì)胞。秋水仙素濃度為0.003%和0.005%的處理中，因濃度高出現(xiàn)明顯的藥害作用。從存活率和變異率兩方面考慮，本研究認(rèn)為秋水仙素濃度為0.002%處理效果較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 秋水仙素藥劑培養(yǎng)基法對(duì)越橘3個(gè)品種誘導(dǎo)多倍體的影響Table 1 Effect of medium with colchicine on polypoid induction of three blueberry cultivars

由表1可知，在對(duì)不同越橘品種處理效果方面，埃利奧特好于達(dá)柔，達(dá)柔好于美登。通過(guò)對(duì)達(dá)柔和埃利奧特2個(gè)品種第一次繼代處理材料進(jìn)行根尖染色體鑒定，變異率不到8.0%。由于變異細(xì)胞較少，在第二次繼代培養(yǎng)后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變異植株。

2.2 浸漬法對(duì)越橘試管苗莖段誘導(dǎo)多倍體的影響

在秋水仙素濃度0.05%的浸漬處理中，除美登在24 h浸漬處理中得到變異植株外，其他品種在6、12和24 h均沒(méi)有得到變異植株。在0.1%的處理中，3個(gè)供試品種誘變效果較好，尤其是在24 h浸漬處理中得到了較高的變異率（見(jiàn)表2）。在0.2%的處理中，隨著浸漬時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率和變異率都明顯下降。從存活率和變異率兩方面考慮，本研究認(rèn)為秋水仙素濃度為0.1%，浸漬24 h效果最好。

從表2中可知，不同的越橘品種表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。即在時(shí)間一定的情況下，存活率呈直線(xiàn)下降，而變異率則呈單峰曲線(xiàn)。綜合3個(gè)品種的處理結(jié)果來(lái)看，達(dá)柔的誘導(dǎo)效果最好，在秋水仙素濃度為0.1%，浸漬處理24 h的試驗(yàn)組合中，存活率為28.9%，變異率22.6%。對(duì)得到的變異植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并對(duì)其后代進(jìn)行鑒定。

表2 不同秋水仙素濃度浸漬24 h對(duì)不同品種單芽莖段誘導(dǎo)多倍體的影響Table 2 Effect of different colchicine concentration and soaking 24 h on polypoid induction of mutation from blueberry buds

2.3 細(xì)胞學(xué)鑒定比較

2.3.1 根尖細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)

對(duì)所獲得的3個(gè)品種誘變株系進(jìn)行根尖染色體鑒定（見(jiàn)表3）。第一次繼代的8個(gè)株系全為嵌合體，無(wú)一株是同質(zhì)四倍體。從整體上看，幾乎所有異常株系染色體加倍細(xì)胞比例均較低，變動(dòng)幅度13.2%～36.4%之間。其中最高是達(dá)柔，誘變株系染色體加倍細(xì)胞為36.4%，二倍體細(xì)胞占多數(shù)（見(jiàn)圖1）。

表3 秋水仙素浸漬單芽莖段誘變株系倍性鑒定Table 3 Chromosome variation of mutational lines induced by soaking buds in colchicine liquid

圖1 達(dá)柔組培苗根尖染色體計(jì)數(shù)Fig.1 Chromosomes of root-tip cell in Darrow

2.3.2 流式細(xì)胞光度法鑒定

結(jié)果見(jiàn)圖2。

利用流式細(xì)胞儀對(duì)植物細(xì)胞倍性進(jìn)行檢測(cè)，橫座標(biāo)是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度，用“道數(shù)”（Channel No.）來(lái)表示，其值與細(xì)胞內(nèi)DNA含量成正比。縱座標(biāo)表示被測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。對(duì)變異株系進(jìn)行DNA含量測(cè)定，達(dá)柔對(duì)照二倍體植株只有一個(gè)主峰，位于橫坐標(biāo)大約50的位置。變異株有兩個(gè)主峰，第一個(gè)峰的位置與對(duì)照相同，第二個(gè)峰的位置是對(duì)照峰值的二倍。由于熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)DNA含量成正比，說(shuō)明經(jīng)秋水仙素浸漬誘導(dǎo)的變異株系體內(nèi)含有兩種DNA含量的細(xì)胞，即二倍體和四倍體細(xì)胞的嵌合體。在嵌合體中，二倍體細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，這與根尖染色體壓片所得結(jié)果一致。

圖2 越橘達(dá)柔變異植株DNA含量分析Fig.2 DNA content distribution of mutational Darrow plant

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)中選用了兩種秋水仙素處理材料的方法，但藥劑培養(yǎng)基法處理效果不如浸漬法。浸漬法誘導(dǎo)在本試驗(yàn)中獲得了變異株系，其中達(dá)柔品種最高變異率達(dá)22.6%。本研究認(rèn)為誘導(dǎo)處理中保證植株良好的生長(zhǎng)狀況、創(chuàng)造細(xì)胞分裂的最佳生長(zhǎng)條件、選擇適宜的秋水仙素濃度和作用時(shí)間，是誘導(dǎo)多倍體成功的關(guān)鍵。王娜等用50 mg·L-1秋水仙素處理40 d誘導(dǎo)酸棗和冬棗，得到了同質(zhì)的四倍體[8]。劉慶忠等將皇家嘎拉蘋(píng)果離體新梢的葉片放入含0～200 mg·L-1秋水仙素的液體分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，獲得四倍體植株[9]。

在誘導(dǎo)植物多倍體時(shí)，嵌合體是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象。韓禮星等在誘導(dǎo)獼猴桃多倍體研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后代全部為嵌合體[10]。馬愛(ài)紅等在進(jìn)行四倍體葡萄誘導(dǎo)的試驗(yàn)中得到了二倍體和四倍體的嵌合體[11]。本研究通過(guò)根尖進(jìn)行染色體鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株系多為二倍體和四倍體的嵌合體。利用流式細(xì)胞儀對(duì)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)也證明誘變材料后代均為嵌合體。如何進(jìn)行越橘誘變株系嵌合體的分離和純化將是下一步研究的重點(diǎn)。

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物細(xì)胞倍性是近幾年在我國(guó)興起的一項(xiàng)新技術(shù)。本試驗(yàn)對(duì)越橘組培苗變異株鑒定采用根尖染色體計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量相結(jié)合的方法，鑒定結(jié)果一致，說(shuō)明流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法可靠。李等將流式細(xì)胞光度術(shù)用于草莓倍性的鑒定，結(jié)果也證明隨著倍性水平的增加細(xì)胞核DNA含量隨之成倍增加[12]。張俊娥等采用倍性分析儀成功地鑒定了柑橘愈傷組織的遺傳變異[13]。但由于越橘試管苗單株小，單株重達(dá)不到流式細(xì)胞儀測(cè)試用量（約0.5～1.0 g），故測(cè)試結(jié)果只能反應(yīng)群體試管苗的倍性，不能反映越橘試管苗單株的倍性。所以采用根尖壓片法和流式細(xì)胞儀分析相結(jié)合的方法鑒定越橘試管苗倍性是必要的。

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