梔子苷對大鼠局灶性腦缺血模型缺血腦組織HIF-1α蛋白和RTP801的影響

辛海濤 王衛(wèi)寧

缺氧誘導因子-1[1](HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體的一種轉錄因子。迄今發(fā)現(xiàn)HIF-1的直接啟動基因有60多個，其中包括一些對缺氧適應性基因，如促紅細胞生成基因、EPO編碼基因等，還有一些HIF-1依賴的凋亡相關基因，如caspase、RTP801、bcl-2等。在嚴重缺血缺氧時，HIF-1可激活凋亡途徑，HIF-1誘導神經細胞凋亡在缺血缺氧損傷的病理過程中起重要作用。RTP801[2]是HIF-1α依賴的凋亡相關基因，嚴重的局灶性腦缺血時，HIF-1促進RTP801的表達，神經元凋亡增加。凋亡在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用[3]，且在梗死形成過程中發(fā)揮了重要作用。梔子苷對腦缺血再灌注損傷具有保護作用[4]，但機制尚不明確。為此本研究采用大鼠腦缺血再灌住模型，觀察藥物對腦組織細胞凋亡及細胞凋亡級聯(lián)反應途徑關鍵蛋白HIF-1α的含量和HIF-1依賴的凋亡相關基因RTP801 mRNA表達的影響，深入研究其腦保護的分子機制。

表1 免疫組織化學染色顯示各組大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α陽性細胞數(shù)(個/高倍視野，40×10倍)

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠(體重300～350g)，隨機分為假手術組、模型組、梔子苷(低劑量、中劑量、高劑量)組和尼莫地平組，后者為陽性對照組，每組均為8只動物。

1.2 動物模型制作 參照Longa法[5]，用3.5%的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，手術分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，結扎ECA和CCA近心端，于CCA遠心端備線，于ICA近心端置一動脈夾，在CCA近分叉處剪一約0.2mm的‘V’字形切口，插入栓線，插入深度(18.5±0.5)mm，使栓線進入ICA，到達大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)起始部，阻斷大腦中動脈的血液供應。假手術對照組不插入栓線，其他步驟同模型組。選取模型成功的標志為大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側Horner征和對側以前肢為重的偏癱。

1.3 給藥方式及途徑 采用腹腔注射方式給藥，梔子苷(低劑量、中劑量、高劑量)組、尼莫地平組造模前1h均預防性給藥1次。各給藥組分別給藥3、6、12、3mL/kg，給藥用生理鹽水稀釋至24mL/kg間隔4h第2次給藥，2次給藥后10h第3次給藥。模型組腹腔注射生理鹽水24mL/kg，梔子苷由課題組制備，濃度4.0mg/mL；尼莫地平購至拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號J20050050，規(guī)格0.2mg/mL。

1.4 免疫組化 各組動物缺血1h，再灌住24h，迅速斷頭、取腦。取視交叉前后1mm腦組織做石蠟切片。石蠟切片用于免疫組化染色，一抗為HIF-1α的單克隆抗體為1∶100(Santa Cruz公司，美國)，二抗及辣根酶標記鏈酶卵白素為1∶200(北京中山生物技術有限公司)，DAB鏡下顯色。HIF-1α陽性細胞是細胞質和(或)細胞核著色呈棕黃色。每張切片均在左側大腦皮質缺血半暗帶區(qū)，高倍視野下(40×10)計數(shù)200個神經元細胞中的陽性細胞數(shù)。

1.5 RT-PCR 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，在冰盒上迅速分離雙側海馬，置凍存管中后放于-80℃低溫冰箱保存。Trizol試劑盒提取-80℃保存的腦細胞總RNA，程序參照試劑盒操作手冊，反應體系20μL，核酸分析儀對RNA樣品定量。RT-PCR反應引物由寶生物公司合成，RTP801上游引物：5’-AAGAGCTGCCATAGTGTGGCT-3’，下游引物：5’-TTCAGACCATGAGATCTGTCG-3’；β-actin上游引物：5’-ATGGATGACGTATCGCTG-3’，下游引物：5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’，PCR程序：94℃2min，94℃30s，56℃30s，72℃45s共35個循環(huán)，72℃5min，4℃保存。擴增產物5μL 加樣于2%瓊脂糖凝膠，常規(guī)電泳，紫外燈下觀察結果，用Bio-rad凝膠分析系統(tǒng)對PCR產物進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結果以(±s)表示，采用t檢驗。

圖1 RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結果

2.1 梔子苷對缺血腦組織HIF-1α表達的影響 各組大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α的表達詳見表1。假手術組亦有少量表達，模型組的表達增加，各治療組的表達比模型組減少，并且呈劑量依賴性，但仍高于假手術組，各治療組HIF-1α的表達與假手術組、模型組相比都有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 RT-PCR檢測RTP801 mRNA的表達 在假手術組大鼠海馬中未見RTP801mRNA的表達，而模型組中可見RTP801mRNA的表達增加，治療組中RTP801mRNA的表達與模型組相比減少，而且隨著治療藥物劑量的增加，RTP801 mRNA的表達量逐漸減小(圖1)。

3 討論

梔子苷治療后大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α的表達量下降，與模型組、尼莫地平組相比都有顯著性差異(P＜0.05)；RTP801 mRNA的表達與模型組相比減少，而且隨著治療藥物劑量的增加，RTP801 mRNA的表達量逐漸減小。本實驗證明梔子苷對局灶性腦缺血急性期的神經保護作用，其可能機制之一為梔子苷抑制局灶性腦缺血損傷引起的的HIF-1α過渡表達，減少HIF-1依賴性凋亡相關基因RTP801的表達，減少神經元凋亡，從而減輕了缺血造成的損傷，起到了一定的神經保護作用，其作為腦缺血臨床治療具有一定的前景。但是，關于梔子苷在局灶性腦缺血病理過程中的應用最佳劑量、最佳時期以及副作用等方面還有待于進一步深入探討。

[1]王晗,韓忠朝.缺氧誘導因子-1與細胞凋亡[J].國外醫(yī)學:生理.病理科學與臨床分冊,2005,25(1):52-54.

[2]Tzipora Shoshani,Alexander Faerman,IgorMett,et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-Responsive Gene,RTP801，involved in apoptosis[J].Molecular and Cellular Biology,2002,22(7):2283-2293.

[3]馮俊奇,李秀蘭,白人驍.細胞凋亡機制研究進展[J].國際生物醫(yī)學工程雜志,2006,29(1):45-64.

[4]張小燕,張占軍,王忠,等.梔子苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達譜的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2005,25(1):42-44.

[5]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.