EGCG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RECK基因甲基化以及p38磷酸化的影響

王柏琦 陳艷華

RECK基因是1998年發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，它能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性[1]，而后者能降解基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而在腫瘤細(xì)胞中，RECK基因幾乎不表達(dá)或低表達(dá)，而且其啟動(dòng)子區(qū)域通常有異常的甲基化而失活。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是從綠茶中提煉出的一種茶多酚。體外研究表明，它能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。本研究試圖探討EGCG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RECK甲基化有何影響，以及與細(xì)胞增殖、分化與死亡等多種生理活動(dòng)的關(guān)鍵分子——p38信號(hào)通路的激活有何關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)?？筆38磷酸化/非磷酸化單克隆抗體購(gòu)自Cell signaling，EGCG為Sigma產(chǎn)品(純度98%)，SB203580購(gòu)自Meck。基因甲基化特異性PCR(MSP)擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Chemicon，Wizard DNA純化試劑盒購(gòu)自Promega，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾 HT-29于含McCoy’s 5-A和含10%馬血清的培養(yǎng)液(Gibco)中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前調(diào)整密度為104/ml，隨后與50μM EGCG孵育36h。完畢后用PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶K37℃23h，隨后加平衡酚及氯仿/異戊醇抽提，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀。用70%乙醇洗滌后收集沉淀DNA并測(cè)定DNA含量和純度。亞硫酸氫鹽修飾按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.3 PCR 甲基化特異性RECK基因引物按照參考文獻(xiàn)提供的方法設(shè)計(jì)[3]，序列由上海生工合成。反應(yīng)條件：95℃10min預(yù)變性后，進(jìn)入95℃30s，56℃30s，72℃30s的循環(huán)，共計(jì)40次，末次循環(huán)后72℃7min，終止反應(yīng)。同時(shí)選用GAPDH作為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 Western blot 細(xì)胞孵育結(jié)束后，加入100～200μl裂解液的比例加入裂解液，充分裂解后，10000rpm離心5分鐘，取10μg蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%BSA4℃封閉過(guò)夜后與抗p38單克隆抗體孵育，經(jīng)TBST洗膜、孵二抗后ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 EGCG能降低HT-29細(xì)胞RECK基因啟動(dòng)子甲基化水平 如圖1所示，HT-29細(xì)胞靜息狀態(tài)下可檢測(cè)出明顯的甲基化條帶(圖1A: lane 1)，當(dāng)與50μM EGCG孵育36h后，其甲基化水平明顯降低(圖1A: lane 2)，而非甲基化基因有所增高(圖1 B：lane 2)。內(nèi)參GAPDH在各組中均保持恒定。p38特異性抑制劑SB203580也具有EGCG類似的效果(圖1A、B：lane 3)。

2.2 EGCG能抑制p38磷酸化 HT-29細(xì)胞細(xì)胞未加入EGCG時(shí)，Western blot結(jié)果顯示p38具有較高的磷酸化水平(圖2A：lane 1)，當(dāng)與50μM EGCG孵育36h后，其磷酸化水平明顯降低(圖2A：lane 2)。而總p38在實(shí)驗(yàn)前后保持恒定(圖2B)。

3 討論

在人類探索腫瘤的曲折道路中，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，尤其是抑癌基因甲基化失活是近年來(lái)的一大研究熱點(diǎn)。茶多酚是從綠茶中提取的一種多酚化合物，其中主要活性成分為EGCG，它對(duì)多種腫瘤，包括胃腸道腫瘤，前列腺癌，宮頸癌，白血病等具有化學(xué)預(yù)防作用。迄今為止，有關(guān)EGCG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響方面的研究相對(duì)較少。在本研究過(guò)程中，我們?cè)噲D研究EGCG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RECK基因甲 基化是否 具有抑制效 應(yīng)，并從 腫瘤發(fā)生的 重要信號(hào)通路p38激酶 出發(fā)，探 討EGCG對(duì)p38磷酸化有何 影響，為治療結(jié)腸癌 尋找一種新 的有效化 療藥物提供 理論基礎(chǔ) 。

圖1 EGCG對(duì)HT-29細(xì)胞RECK基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響

圖2 EGCG對(duì)HT-29細(xì)胞p38磷酸化的影響

本研究通過(guò)采用MSP法對(duì)RECK基因甲基化進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：EGCG處理后的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞RECK基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)明顯降低，而非甲基化的RECK基因有所增多，表明EGCG能逆轉(zhuǎn)腫瘤組織中的RECK甲基化水平。癌變是正常細(xì)胞分化異常、增殖過(guò)度與凋亡受阻的結(jié)果，信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常在這些過(guò)程中起重要作用，其中，生長(zhǎng)因子激活的受體酪氨酸激酶?jìng)鲗?dǎo)通路與細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)傳導(dǎo)通路之一[4]，經(jīng)EGCG孵育后的結(jié)腸癌細(xì)胞p38磷酸化水平受到明顯抑制，同時(shí)，經(jīng)p38特異性抑制劑SB203580處理后的HT-29細(xì)胞，RECK甲基化情況與EGCG類似，說(shuō)明在EGCG誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞表達(dá)RECK的過(guò)程中，RECK基因的甲基化水平很可能受到p38的調(diào)節(jié)。EGCG—p38—RECK—MMP這一傳導(dǎo)通路的關(guān)系，在EGCG的抗腫瘤過(guò)程中很可能具有重要作用。

[1]Takahashi C,Sheng Z,Horan TP,et al.Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998 Oct 27,95(22):13221-13226.

[2]Ho YC,Yang SF,Peng CY,et al.Epigallocatechin-3-gallate inhibits the invasion of human oral cancer cells and decreases the productions of matrix metalloproteinases and urokinase-plasminogen activator[J].J Oral Pathol Med,2007 Nov,36(10):588-593.

[3]Fang MZ,Wang Y,Ai N,et al.Tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits DNA methyltransferase and reactivates methylation-silenced genes in cancer cell lines[J].Cancer Res,2003 Nov 15,63(22):7563-7570.

[4]Feng Y,Wen J,Chang CC.p38 Mitogen-activated protein kinase and hematologic malignancies[J].Arch Pathol Lab Med,2009 Nov,133(11):1850-1856.