烏司他丁對(duì)急性重癥膽管炎大鼠TNF-α、IL-10的影響研究

閆振濤 單世勝

急性重癥膽管炎(ACST)又稱(chēng)急性梗阻性化膿性膽管炎(AOSC)，是膽道系統(tǒng)中最嚴(yán)重的疾病之一，其具有發(fā)病急、病情重、變化快、并發(fā)癥多、死亡率高等點(diǎn)。因膽道梗阻引起的繼發(fā)性細(xì)菌感染、內(nèi)毒素入血引起膿毒癥，可進(jìn)一步引起炎癥因子激活，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器功能不全綜合征(MODS)。阻斷炎癥因子的過(guò)度表達(dá)已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。烏司他丁是從男性尿液中分離純化的一種糖蛋白，是近年來(lái)研制成功并已廣泛運(yùn)用于臨床的一種蛋白酶抑制劑。它除了對(duì)多種蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，還能穩(wěn)定溶酶體膜，有抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放以及清除氧自由基等功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬大鼠急性重癥膽管炎模型，研究烏司他丁對(duì)TNF-α、IL-10的影響。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠48只(購(gòu)自于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重180～220g，大鼠術(shù)前12小時(shí)禁食，4小時(shí)禁水。分為(1)正常對(duì)照組12只，麻醉后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只在8h，24h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后處死；(2)假手術(shù)組12只，麻醉后按手術(shù)步驟暴露膽總管關(guān)腹，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只在8h，24h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后處死；(3)模型組12只，按手術(shù)步驟制備急性重癥膽管炎關(guān)腹，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只在8h，24h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后處死；(4)烏司他丁組12只，實(shí)驗(yàn)前3天起腹腔注射烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)，按體重5.0×104U/kg，q.d，最后一次注射后2h制備急性重癥膽管炎關(guān)腹，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只在8h，24h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后處死。

1.2 模型制備 手術(shù)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。用20%烏拉坦(0.5ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉，常規(guī)備皮消毒，鋪無(wú)菌洞巾。取上腹正中切口進(jìn)腹，顯露肝臟下緣，找到并提起十二指腸，顯露肝十二指腸韌帶找到走行其淺面的膽總管，于胰管匯入上緣3-0線結(jié)扎膽總管。3號(hào)套管針膽總管內(nèi)穿刺注入配置好LPS10μg/ml，(注射時(shí)間為lmin)，于穿刺孔近端再次結(jié)扎膽總管后關(guān)腹[1]。

1.3 血清TNF-α、IL-10檢測(cè) 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，靜置30min后，離心取血清，-70℃保存待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒要求操作，檢驗(yàn)血清TNF-α、IL-10濃度，ELISA試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中TNF-α的表達(dá) 假手術(shù)組與正常對(duì)照組血清中TNF-α沒(méi)有差異(P＞0.05)，模型組中8h與24h血清中TNF-α較之假手術(shù)組及正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，烏司他丁組中8h，24h血清中TNF-α較之模型組明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組血清中IL-10的表達(dá) 假手術(shù)組與正常對(duì)照組血清中IL-10沒(méi)有差異(P＞0.05)，模型組中8h與24h血清中IL-10較之假手術(shù)組及正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，烏司他丁組中8h，24h血清中IL-10較之模型組明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

急性重癥膽管炎發(fā)病急驟，病情發(fā)展迅速，如不及時(shí)解除膽道梗阻，將導(dǎo)致病情惡化，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能不全綜合征。相關(guān)研究表明，急性重癥膽管炎大鼠可引起肺臟損傷，其低氧血癥和高碳酸血癥等肺功能改變與肺臟病理改變平行。而膽道梗阻所引起進(jìn)入膽腸循環(huán)的膽鹽減少，可誘發(fā)腸道粘膜屏障破壞，導(dǎo)致膿毒癥。隨著研究的進(jìn)展[2]，目前炎癥學(xué)說(shuō)在全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能不全綜合征的發(fā)病機(jī)制中已經(jīng)得到廣泛的承認(rèn)。細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放、促炎介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的失衡是此過(guò)程的病理生理變化的重點(diǎn)。在細(xì)菌與LPS刺激機(jī)體引發(fā)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放的促炎介質(zhì)中，TNF-α作用最為重要[3]。TNF-α能夠引起炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)其他炎癥因子的持續(xù)性釋放，而這些因子又能增強(qiáng)TNF-α的釋放和作用，從而導(dǎo)致炎癥的瀑布樣反應(yīng)。同時(shí)TNF-α還能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變血流動(dòng)力學(xué)及誘發(fā)凝血功能的異常，加重組織損傷。IL-10被認(rèn)為是體內(nèi)最為重要的抗炎因子，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起非常重要的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[4]，預(yù)防使用IL-10可以減輕內(nèi)毒素相關(guān)的炎癥細(xì)胞介質(zhì)釋放及浸潤(rùn)，纖溶合凝血系統(tǒng)改變等病理生理學(xué)變化。

表1 在8、24h采血各組大鼠血清中TNF-α水平比較

表2 在8、24h采血各組大鼠血清中IL-10水平比較

烏司他丁是一種廣譜的酶抑制劑，能夠抑制胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、蛋白蛋白酶等多種水解酶的活性，并能夠抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放及清除氧自由基等功能。臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于休克、急性胰腺炎、MODS的治療。研究表明，烏司他丁可以下調(diào)促炎因子，起免疫調(diào)理作用，有利于改善機(jī)體炎癥反應(yīng)的過(guò)程，其過(guò)程可能是通過(guò)抑制組織器官中P38MAPK的磷酸化，從而干擾炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備急性重癥膽管炎動(dòng)物模型，并通過(guò)烏司他丁給予干預(yù)，動(dòng)態(tài)的觀察血清中促炎因子TNF-α與抗炎因子IL-10的水平。發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠抑制TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，從而為治療急性重癥膽管炎提供新的思路。

[1]楊慷,劉作金龔建平等.肝組織清道夫受體A在急性重癥膽管炎時(shí)的表達(dá)與內(nèi)毒素性肝損傷的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2009,17(2):141-145.

[2]Houli Wang MD,Sui Ma MD.The cytokine storm and factors determining the sequence and severity of organ dysfunction in multiple organ dysfunction syndrome[J].The American Journal of Emergency Medicine,2008,26(6):711-715.

[3]Xian-Ming Chen,Steven P.O'Hara,JeremyB.Nelsone,et al. MultiPle TLRs are expressed in human cholangioeytes and mediate host epithelial defense responses to cryptosporidium parvum via activation of NF-κB[J].The Journal of Immunology,2005,175:7447-7456.

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[5]唐皓,熊艷,梁艷冰等.烏司他丁對(duì)多器官功能障礙患者COX-2、p38MAPK和CRP的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2008,29(4S):26-28.