利用毛細管電泳測定牛乳和山羊乳混合乳的蛋白質(zhì)

石 燕，姜金斗，劉 寧,*

（1.乳品科學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150086）

隨著人們生活水平的不斷提高，鮮乳的消費量日漸增加，在歐洲，綿羊乳和山羊乳的飲用已經(jīng)有千年的歷史，具有重要的營養(yǎng)價值與經(jīng)濟價值[1]。奶山羊是人類的三大奶源之一，是羊乳的主要來源，被譽為“不用冰箱的奶庫”和“貧民的奶牛和聚寶盆”[2]。近些年，由于羊乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊乳需求量的增大，摻假行為屢有發(fā)生。出現(xiàn)這種摻假行為的原因有：綿羊和山羊乳產(chǎn)量不高，季節(jié)性波動大，并且價格較貴；國外不法企業(yè)將產(chǎn)量過剩的牛乳摻入羊乳，以減少損失[3]。而在我國，一些不法分子為了追求高額利潤，在牛乳中摻入價格相對低廉的山羊乳，嚴重影響了牛乳的口感與質(zhì)量，也影響到了一些以鮮乳為原料的干酪制品的質(zhì)量[4]，使乳制品生產(chǎn)廠家蒙受巨大損失。因此，混合乳檢測方法的確立，是食品檢驗和執(zhí)法部門當前所面臨的重要問題。

目前毛細管區(qū)帶電泳（CE）測定羊乳中摻入牛乳已有報道，主要以乳清蛋白的分析為基礎(chǔ)，有研究用毛細管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）的方法檢測羊乳中摻入的牛乳量，根據(jù)所測的不同乳中的β-乳球蛋白（β-LG）的峰值進行定量檢測[3]。Bramanti等利用高效液相色譜（HPLC）分析 αs1/κ、αs2/β、β/κ和αs2/αs1，這些酪蛋白的峰面積值可作為羊乳中摻入牛乳的檢測指標[5]。HPLC同大多數(shù)定性定量分析乳中蛋白質(zhì)的方法一樣，要求首先把乳清蛋白和酪蛋白分離開，再進行分析，而毛細管電泳則不需要此過程，因此它可以提供一種快速、高分辨率、良好量化并適合于各種混有乳產(chǎn)品的分析手段[6-7]。

通過參考并比較國內(nèi)外相關(guān)研究文章，本文采用毛細管電泳法研究了混合乳中的蛋白，選取特定酪蛋白的遷移時間做定性研究，根據(jù)特定酪蛋白峰面積的比值做定量研究，建立混合乳的定性定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

新鮮牛乳、山羊乳（采自八五二農(nóng)場）；5種乳蛋白標準品（購自Sigma公司）；檸檬酸（購自天津東麗化學試劑公司）；檸檬酸鈉（購自天津凱通化學試劑公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC）（購自山東瑞泰化工）；氨基丁三醇（Tris）（購自Sigma公司）；3-（N 嗎啉）-2-羥基丙磺酸（MOPOS）（購自索來寶公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（購自Sigma公司）；二硫代蘇糖醇（DTT）（購自Sigma公司）；尿素（購自天津市風船化學試劑公司）。

1.1.2 儀器

P/ACE MDQ毛細管電泳儀，配有紫外檢測器，美國Beckman公司；聚丙烯酰胺涂層毛細管；60 cm×50 μm i.d.美國 Beckman 公司；臺式離心機TCL-16C，上海安亭科學儀器廠；DELTA320 pH計，梅特勒-托利多公司；超純水儀，美國MILLPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 緩沖溶液的配制[8]

電泳緩沖液：0.32 mol·L-1檸檬酸，20 mmol·L-1檸檬酸鈉，6 mol·L-1尿素，0.05%HPMC，調(diào)節(jié)pH到3.0，用0.45 μm濾膜過濾，備用。

樣品緩沖液：用 167 mmol·L-1Tris、42 mmol·L-1MOPOS、67 mmol·L-1EDTA 鈉鹽、17 mmol·L-1DTT、6 mol·L-1尿素和 0.5 g·L-1HPMC，調(diào)節(jié) pH 到 8.6，用0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.2.2 樣品處理[9]

原料乳：將鮮乳與樣品緩沖溶液按1：4 V/V的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r·min-1離心5 min，取中間澄清液用0.45 μm濾膜過濾，備用。

混合乳：各取新鮮牛乳、山羊乳分別按體積比10： 90、 20： 80、 30： 70、 40： 60、 50： 50、 60： 40、70： 30、80：20 和 90： 10 的比例混合，然后將混合溶液與樣品緩沖液按1：4 V/V的比例混合，室溫下放置1 h， 10 000 r·min-1離心5 min，取中間澄清液用0.45 μm濾膜過濾，備用。

標準蛋白：用樣品緩沖液將α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和 κ-酪蛋白（κ-CN）分別配制成不同濃度的標準溶液，備用。

儀器操作條件：壓力進樣：0.5 psi，5 s，柱溫25℃，分離電壓為25 KV，紫外檢測波長214 nm。進樣前和樣品間沖洗程序：0.1 mol·L-1HCl沖洗2 min，超純水沖洗2 min，電泳緩沖液沖洗5 min。

1.2.3 分析指標

根據(jù)混合乳中各酪蛋白的遷移時間作為定性檢測指標，且滿足分析條件的遷移時間和峰面積的RSD＜5%。根據(jù)選定的酪蛋白峰面積之間的比值作為定量檢測指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳和山羊乳混合乳的研究

2.1.1 不同物種間乳的毛細管區(qū)帶電泳圖譜

測定牛乳和山羊乳中蛋白質(zhì)得到的電泳圖譜如圖1所示。通過對照牛乳中各個乳蛋白標準樣品的遷移時間，可定性明確其中的主要乳蛋白成分，如圖1b所示。參考Jose等研究的山羊乳中的蛋白遷移時間及順序，根據(jù)本研究結(jié)果可明確該山羊乳樣品中的主要蛋白成分，如圖1a所示[8,10]。根據(jù)遷移時間的不同，能夠明顯看出兩種原料乳中的蛋白成分不同，表明山羊乳與牛乳所含蛋白成分有很大差別。另外，該實驗方法能夠使乳中所含的各種蛋白成分得到較好的分離，且圖譜清晰明了。

利用酪蛋白片段遷移時間的不同作為檢測指標。由圖1可知，不同乳中酪蛋白遷移順序相同：牛乳酪蛋白：αs2-CN＜αs1-CN＜αs0-CN＜κ-CN＜βcasein A1＜β-casein A2；羊乳酪蛋白：αs2-CN＜αs1-CN＜κ-CN＜β2-CN＜β1-CN。但遷移時間不同。通過對比發(fā)現(xiàn)不同品種乳的αs0-CN、αs1-CN、κ-CN和β-CN等的遷移時間明顯不同，因此選取了牛乳的αs1-CN、αs0-CN、κ-CN、β-casein A1和山羊乳的β-CN、β1-casein來進行進一步的研究。

圖1 乳蛋白毛細管區(qū)帶電泳Fig.1 Capillary electropherogram of milk protein

2.2 混合乳的定性檢測

將混合比例為50：50（V/V）的牛乳和山羊乳混合樣品進樣分析，得到混合乳的電泳圖譜如圖2所示。連續(xù)進樣10次，根據(jù)電泳圖計算各酪蛋白片段遷移時間和峰面積的平均值以及它們的相對標準偏差，結(jié)果如表1所示。并從中選出遷移時間和峰面積的RSD較小值對應(yīng)的酪蛋白作為定性鑒定的酪蛋白。

圖2 混合乳的毛細管區(qū)帶電泳Fig.2 Capillary electropherogram of milk mixture

由表1可知，所測的遷移時間的RSD值中，牛乳的αs0-CN、β-CN A1和山羊乳中的β-CN、β1-CN所得的值相對較??；而相對峰面積的RSD值中，牛乳的αs1-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN相對較小，而牛乳的κ-CN和αs0-CN的相對峰面積的RSD較高。各酪蛋白的遷移時間和相對峰面積的RSD值均小于5%，表明選擇的酪蛋白片段的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，這些酪蛋白均可以作為定性檢測混合乳的特定酪蛋白。

2.3 混合乳的定量檢測

綜合考慮上述所得結(jié)果，排除峰值較小的牛乳中的κ-CN和αs0-CN，選定牛乳αs1-CN、β-CN A1和山羊乳β-CN、β1-CN做定量研究。將配制成不同比例的混合乳樣品進樣分析，計算不同酪蛋白的峰面積之間的比值，并考察各酪蛋白峰面積比值與混合乳比例是否呈線性相關(guān)性，結(jié)果見表2。

表1 混合乳中酪蛋白遷移時間、相對峰面積平均值及相對標準偏差（n=10）Table 1 Mean and relative standard deviation of the migration times and the relative peak areas of the caseins in milk mixture(n=10)

表2 酪蛋白峰面積比值及檢測限Table 2 Ration of different casein peak area and the detection limit of mixed milk

混合乳中的牛乳αs1-CN和山羊乳β1-CN峰面積比值與牛乳百分含量的關(guān)系如圖3所示，以混合乳中牛乳的百分含量為橫坐標，以αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）峰面積的比值為縱坐標做的標準曲線圖，由圖3可見線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)可達0.9973。

混合乳中的牛乳β-CN A1和山羊乳β-CN峰面積比值與牛乳百分含量的關(guān)系如圖4所示，以混合乳中牛乳的百分含量為橫坐標，以β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）峰面積的比值為縱坐標做的標準曲線圖，由圖4可見線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)可達0.998。

由表2所列數(shù)據(jù)和圖3和圖4所做的標準曲線可知 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）和 β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）的峰面積比值與混合乳的比例存在著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，因此αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）和β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）的峰面積比值可以作為混合乳的定量檢測指標。牛乳的檢測限分別能達到2%和3%。

圖3 牛乳αS1-CN和山羊乳β1－CN峰面積比值與牛乳的百分量的線性關(guān)系Fig.3 Linear correlation of peak areas on cow's casein αS1-CN and goat's casein β1－CN with cow's milk contents

圖4 牛乳β－CN A1與山羊乳β－CN峰面積比值與牛乳的百分量的線性關(guān)系Fig.4 Linear correlation of peak areas on cow's casein β－CN A1and goat's casein β－CN with cow's milk contents

3 討論

a.選取涂層毛細管區(qū)帶電泳法分析了不同物種間的乳蛋白，由于毛細管電泳技術(shù)具有高效和明顯減少溶劑浪費等特點，加速了乳品質(zhì)量快速檢測和自動化分析的進程[11-13]。因此選擇毛細管電泳方法來測定混合乳中的蛋白比其他檢測方法更具優(yōu)勢。由于毛細管電泳中蛋白質(zhì)對管壁有較強的吸附作用，影響分離效率，常會出現(xiàn)峰高降低甚至不出峰的現(xiàn)象，蛋白質(zhì)吸附同時引起電滲流的變化和分離效率顯著降低，所以蛋白質(zhì)分離首要解決的問題就是吸附問題，本文選擇的聚丙烯酰胺涂層毛細管柱可有效的抑制管壁對蛋白的吸附，得到較好的分離效果[14]。本研究中各主要蛋白均得到基線分離，證明該方法分離效果較好。根據(jù)不同乳的蛋白遷移時間可以區(qū)別不同物種乳之間的乳蛋白成分。

b.測定羊乳中摻入牛乳的研究已有報道，主要是以乳清蛋白的定量分析為基礎(chǔ)。毛細管區(qū)帶電泳測得牛乳含量在0～20%的范圍內(nèi)時，牛乳β-乳球蛋白和羊乳α-乳白蛋白的峰面積比率與牛乳含量線性相關(guān)[15]；反相高效液相色譜分析乳清蛋白適合于常規(guī)檢測，但是同時乳清蛋白存在遺傳變異和熱不穩(wěn)定等方面的限制，某些色譜圖譜十分復(fù)雜，分析困難，有些情況下檢測時間過長。而本文得到的乳蛋白電泳圖中酪蛋白較豐富，因此本文選取乳中的酪蛋白作為檢測指標。與以乳清蛋白為檢測指標的研究相比較，本文可選的檢測指標范圍更廣，線性結(jié)果較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。

c.利用乳酪蛋白遷移時間的不同來定性檢測混合乳，但從混合乳蛋白電泳圖中能夠明顯看出有的蛋白峰減小甚至消失，而有的蛋白峰增大。減小的蛋白峰如牛乳的αs2-CN和山羊乳的αs2-CN，可能是由于各自進樣量的減小，峰型不好，不能選擇其作為定性酪蛋白。而牛乳中的β-CN A2和山羊乳中的β2-CN峰重疊，使得混合乳的電泳圖中該位置的峰有所增大，也不能選擇這兩種酪蛋白作為定性酪蛋白。綜合分析，選擇能夠明顯區(qū)分不同物種間且峰型較好的酪蛋白作為定性鑒定的酪蛋白，與利用高效液相色譜研究分析所選的α1-、α2-、β-和κ-casein[5]相比，本研究中選取的酪蛋白包括β-CN亞型，如β1-CN和β-CN A1，酪蛋白峰更加具體，且各種酪蛋白相對遷移時間和相對峰面積的RSD均小于5%，均可以作為定性鑒定的酪蛋白。選擇穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對較好的牛乳中的αs1-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN做定性研究，結(jié)果表明 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）、β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）可以作為混合乳的定量檢測指標，結(jié)果可靠。

本研究結(jié)果表明該方法準確、快速、無污染，為乳的質(zhì)量監(jiān)控提供了一個新的途徑，對乳品產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過采用涂層毛細管區(qū)帶電泳方法測得的混合乳中的蛋白成分，較好的分離各種乳酪蛋白分離效果較好，得到的電泳圖譜清晰明了，且該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。研究選取擇了穩(wěn)定性好的牛乳 αs1-CN、αs0-CN、κ-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN作為定性檢測混合乳的摻假特定酪蛋白，根據(jù)混合乳的不同混合比例與特定酪蛋白 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）、β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）峰面積的比值之間存在著良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均大于0.997，可以作為定量檢測混合乳摻假的指標。

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