流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

趙付榮,華榮虹,王 斌,陳娜莎,阿合買(mǎi)提·買(mǎi)買(mǎi)提,步志高

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150001)

流行性乙型腦炎(JE)簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦,是由乙型腦炎病毒引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。多種動(dòng)物易感,蚊是JEV的主要傳播媒介,豬是其主要的儲(chǔ)存宿主和擴(kuò)散宿主。乙腦對(duì)豬的危害主要為:妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)和死胎,公豬發(fā)生睪丸炎,育肥豬持續(xù)高熱,新生仔豬腦炎。該病主要流行于東亞和南亞各國(guó),而我國(guó)是乙腦發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家,占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上[1]。近年來(lái),乙腦的流行分布范圍呈擴(kuò)大的趨勢(shì),乙腦的診斷和防治研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬,基因組為正鏈單股RNA病毒,基因組長(zhǎng)度11 kb。病毒粒子有3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小為1500 bp,由其編碼的E蛋白是病毒粒子表面最重要的結(jié)構(gòu)蛋白,其表面的抗原決定簇,具有血凝活性和中和活性。E蛋白與病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、保護(hù)性免疫、血凝反應(yīng)和血清特異性有關(guān)[2-4]。本研究成功制備1株抗JEV E蛋白的單克隆抗體,并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行了鑒定,為今后探索新的JE臨床診斷方法及E蛋白結(jié)構(gòu)與功能提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 含E基因的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-E,大腸桿菌 BL21(DE3)、BHK-21細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞,表位融合蛋白GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33、GSTE39、GST-E45、GST-E48、GST-E49 及 GST 純化蛋白均由獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備或保存。實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 重組JEV E蛋白的表達(dá)與純化 將表達(dá)菌種接種于含100 mg/L氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜后,按1∶100接種于新鮮LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加IPTG誘導(dǎo),培養(yǎng)物離心后用1/20體積 PBS重懸,超聲波裂解后12000 r/min離心,分離上清和沉淀,12%SDSPAGE檢測(cè)表達(dá)情況。表達(dá)蛋白包涵體按文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行分離純化。

1.3 小鼠免疫 以純化的 JEV E蛋白對(duì)8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠按如下程序免疫:首次免疫用純化的E蛋白和弗氏完全佐劑等量混合,充分乳化,于小鼠頸背部分多點(diǎn)皮下注射;間隔2周用弗氏不完全佐劑乳化抗原加強(qiáng)免疫2次,取脾細(xì)胞融合前3天用純化抗原經(jīng)尾靜脈加強(qiáng)免疫1次。

1.4 細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選及純化 細(xì)胞融合過(guò)程按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6]進(jìn)行。以純化的E蛋白作為包被抗原,用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆株。將經(jīng)初步篩選得到的可疑陽(yáng)性細(xì)胞克隆株用有限稀釋法再進(jìn)行3～5次單克隆,同時(shí)用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100%時(shí),即可確定已獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。單克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)凍存于液氮中。

1.5 單克隆抗體腹水的制備 取成年的BALB/c小鼠,于腹腔內(nèi)預(yù)先注入0.5mL的弗氏不完全佐劑,1周后,再將篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞分別以3×105個(gè)/0.5mL細(xì)胞的劑量注入小鼠的腹腔,約7 d左右,當(dāng)小鼠的腹腔增大時(shí),抽取腹水,5000 r/min離心取上清,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 單抗效價(jià)的測(cè)定及亞類(lèi)鑒定 切膠純化E蛋白為抗原,用間接ELISA法測(cè)定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水單克隆抗體效價(jià)。亞類(lèi)的鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作。

1.7 Western blot鑒定 參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。以單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗,以SP2/0細(xì)胞上清做陰性對(duì)照,以紅外熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗,用紅外熒光掃描儀進(jìn)行掃描。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定 分別以純化的表位融合蛋白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GSTE19、GST-E33、GST-E39、GST-E45、GST-E48、GST-E49與GST為抗原分別包被ELISA板,用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與表位融合蛋白的反應(yīng)性,以純化的GST蛋白作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)正確后,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析,可見(jiàn)大小約70 ku的目的蛋白的表達(dá),與預(yù)期結(jié)果一致(圖1),且純化后的蛋白可被豬陽(yáng)性血清識(shí)別(圖1)。

圖1 E蛋白表達(dá)的表達(dá)與純化

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)過(guò)融合、間接ELISA檢測(cè)和4次亞克隆,共篩選到1株穩(wěn)定分泌抗JEV E蛋白的雜交瘤細(xì)胞,將其命名為5D4。該雜交瘤細(xì)胞經(jīng)液氮凍存復(fù)蘇后,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,分泌抗體能力正常。

2.3 McAb效價(jià)以及Ig亞類(lèi)鑒定 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液做2倍系列稀釋,腹水先100倍稀釋,再做2倍系列稀釋,以純化E蛋白為包被抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明,細(xì)胞培養(yǎng)上清液的抗體效價(jià)為1∶1024,腹水抗體效價(jià)為1∶409600。經(jīng)鑒定,該單抗亞型為IgG2a,輕鏈為κ鏈。

2.4 單抗的免疫活性分析 將JEV SA14-14-2株接種BHK-21細(xì)胞作為抗原,進(jìn)行SDS-PAGE。通過(guò)半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)印至NC膜,以單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗,以SP2/0細(xì)胞上清做陰性對(duì)照,以FITC標(biāo)記的羊抗鼠紅外熒光作為二抗,然后在紅外熒光掃描儀進(jìn)行掃描。結(jié)果可見(jiàn)15株單抗均能特異性地識(shí)別表達(dá)的重組蛋白及JEV SA14-14-2株感染細(xì)胞中的E蛋白,在53 ku處有一明顯特異反應(yīng)條帶,而陰性對(duì)照 SP2/0培養(yǎng)上清不與JEV E蛋白發(fā)生反應(yīng)(圖2)。

圖2 Western blot檢測(cè)單克隆抗體免疫活性

2.5 單克隆抗體的特異性試驗(yàn) 分別以純化的融合蛋 白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19、GST-E33 、GST-E39 、GST-E45 、GST-E48 、GST-E49和純化的GST蛋白為包被抗原,采用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。結(jié)果顯示,單抗5D4能與GST-E10反應(yīng),而與GST不反應(yīng)。表明該單抗是針對(duì)表位E10的。

3 討論

對(duì)乙型腦炎尚無(wú)特效治療方法,早期診斷仍是有效控制該病的重要手段,各種針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的免疫學(xué)診斷技術(shù)以其特異性強(qiáng)、成本較低、易操作等特點(diǎn)成為實(shí)踐中檢測(cè)病原的常用方法。免疫學(xué)診斷的特異性和準(zhǔn)確性直接取決于診斷試劑,目前應(yīng)用于診斷的抗體制劑多是由全病毒抗原免疫動(dòng)物制備的多克隆抗血清,其復(fù)雜的抗體成分和由不同動(dòng)物個(gè)體和不同批次制備免疫血清造成的抗體效價(jià)的差異,使檢測(cè)的穩(wěn)定性、特異性受到限制。單克隆抗體純度高、專(zhuān)一性強(qiáng)、重復(fù)性好且能在動(dòng)物體外或體內(nèi)產(chǎn)生同質(zhì)性抗體,以它作為診斷抗體能克服多克隆抗血清診斷時(shí)穩(wěn)定性差及非特異性強(qiáng)等缺點(diǎn)。

本試驗(yàn)在制備JEV E蛋白單抗的過(guò)程中,將純化的E蛋白免疫BALB/c小鼠,提高了抗 E蛋白McAb的陽(yáng)性率,用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)建立了1株分泌抗E單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,篩選時(shí)用純化的E抗原包被反應(yīng)板采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),這種高純度的包被抗原使得篩選方法簡(jiǎn)便、高效。獲得的1株能穩(wěn)定分泌抗E的單克隆的雜交瘤細(xì)胞株,Western blot結(jié)果也表明此株抗JEVE蛋白McAb特異性強(qiáng),表位鑒定表明此株單克隆抗體是針對(duì)表位E10的,有研究表明表位E10處于E蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)[8]。從一定意義上說(shuō),表位疫苗是縮微的亞單位疫苗?；诙啾砦坏囊呙绾袕V譜的表位信息,可以避免因病毒變異而造成的疫苗免疫失敗。但在各分離株中高度保守的表位序列(特別是中和表位),在疫苗的研制中具有重要的參考價(jià)值。所以本研究結(jié)果為下一步探索新的JE診斷方式奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為研究E蛋白的免疫保護(hù)機(jī)制提供了物質(zhì)條件。

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