金標(biāo)層析法檢測(cè)豬瘟病毒抗原的臨床應(yīng)用

權(quán)中會(huì),陰明亮,魏揀選,張國(guó)士,馬保華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院西安寵物醫(yī)院,陜西西安710065;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院,陜西楊凌712100)

豬瘟(CSF)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一,在臨床上豬瘟常表現(xiàn)典型和非典型發(fā)病特征,因此及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷尤為重要。免疫膠體金層析診斷法近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,在動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用起步較晚,最近幾年才見(jiàn)到相應(yīng)報(bào)道。該技術(shù)的基本原理是將配體(抗體或抗原)以線(xiàn)狀包被于硝酸纖維素膜等微孔薄膜上,并用膠體金標(biāo)記另一配體或其他物質(zhì)以干態(tài)固定在吸水材料上。當(dāng)加入待檢樣品時(shí),通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng),當(dāng)泳動(dòng)至膠體金標(biāo)記處時(shí),如樣品中含有待檢受體,則發(fā)生第一步特異性免疫反應(yīng)。第一步特異性免疫反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物繼續(xù)泳動(dòng)至線(xiàn)狀包被區(qū)時(shí),發(fā)生第二步特異性免疫反應(yīng),所形成的免疫復(fù)合物被截留在包被的線(xiàn)狀區(qū),通過(guò)標(biāo)記的膠體金而顯紫紅色條帶(檢測(cè)帶),而游離標(biāo)記物則越過(guò)檢測(cè)帶,與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離[1]。該診斷技術(shù)操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng),用時(shí)較短(可在15～25min獲得直觀判斷結(jié)果),特別適合于廣大基層獸醫(yī)人員以及大批量檢測(cè)和大面積普查等[2]。2008年1～7月,我們應(yīng)用豬瘟病毒抗原快速金標(biāo)檢測(cè)卡對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收治的臨床疑似豬瘟或無(wú)名高熱的134頭病豬進(jìn)行了豬瘟病毒抗原檢測(cè)。

1 材料

1.1 豬瘟病毒抗原快速金標(biāo)檢測(cè)卡 深圳市康百得生物科技有限公司出品,批號(hào)20071020。

1.2 待檢樣品 臨床疑似豬瘟病豬或無(wú)名高熱病豬的血液樣本共134頭份,其中哺乳仔豬23頭份,斷奶豬89頭份,母豬22頭份;樣品均為來(lái)本院就診的近15d內(nèi)未接種過(guò)豬瘟疫苗的病豬,主要來(lái)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)和小養(yǎng)豬場(chǎng)。從病豬耳靜脈、前腔靜脈或從病死豬心臟采血,分離血清,或者用EDTAK2抗凝,離心分離血漿。根據(jù)病豬臨床癥狀和病理變化的不同,將樣本分為兩類(lèi)：(1)臨床癥狀和病理變化較典型的疑似豬瘟病例,其樣本55頭份。急性型病豬體溫41℃～42℃,高熱稽留;白細(xì)胞數(shù)降低至10×109以下;眼結(jié)膜潮紅,兩眼有多量黏液、膿性分泌物;皮膚有出血點(diǎn)或斑;初便秘后腹瀉,糞便惡臭;常并發(fā)肺炎和纖維素性壞死性腸炎。慢性型病豬的體溫稽留在 40℃左右;精神委頓,消瘦,貧血,衰弱,病情時(shí)輕時(shí)重,食欲時(shí)好時(shí)壞,糞便時(shí)干時(shí)稀;病程較長(zhǎng)者,皮膚出現(xiàn)淤血斑和壞死塊,以腹下部為多見(jiàn),有時(shí)也出現(xiàn)紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病理變化：急性型呈現(xiàn)以多發(fā)性出血為特征的敗血癥變化,皮膚、黏膜、漿膜廣泛出血,血液凝固不良,消化道、呼吸道和泌尿生殖道有卡他性、纖維素性和出血性炎癥反應(yīng)。淋巴結(jié)水腫、出血,呈暗紅色,切面呈大理石樣色彩;腎臟有針尖狀出血點(diǎn)或大的出血斑,呈現(xiàn)所謂的“雀斑腎”外觀;脾臟邊緣梗死;膀胱、喉頭黏膜及會(huì)厭軟骨上有程度不同的出血點(diǎn);大腸的回盲瓣附近淋巴濾泡腫大隆起、有出血和壞死;病程稍久的病例,可見(jiàn)纖維素性肺炎或壞死性化膿性肺炎,肺胸膜粗糙。慢性型的出血病變輕微,但在回盲口附近及結(jié)腸常有特征性的偽膜性壞死和潰瘍,呈紐扣狀;斷奶仔豬的肋骨末端與軟骨交界處發(fā)生鈣化,可見(jiàn)有黃色骨化線(xiàn)。(2)臨床癥狀和病理變化不典型或無(wú)名高熱病豬,其樣本79頭份。病豬臨床癥狀較輕,體溫一般在40℃～41℃左右;有的病豬耳、尾、四肢末端皮膚壞死,發(fā)育停滯,到后期站立不穩(wěn)、后肢癱瘓,部分跗關(guān)節(jié)腫大。病理變化不典型,淋巴結(jié)水腫,輕度出血或不出血;腎出血點(diǎn)不一致;脾稍腫,有1～2處梗死灶;回盲瓣很少出現(xiàn)紐扣狀潰瘍,但有潰瘍和壞死病理變化。

2 方法

將檢測(cè)卡水平放置,做好標(biāo)記,在檢測(cè)卡的加樣孔內(nèi)加入2滴(70～100μL)待檢血清/血漿樣品,室溫下靜置,20min內(nèi)判定結(jié)果。陽(yáng)性：在觀察孔內(nèi),檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)及對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)同時(shí)出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)。陰性：在觀察孔內(nèi),只有對(duì)照線(xiàn)區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色線(xiàn)。失效：在觀察孔內(nèi),對(duì)照線(xiàn)區(qū)(C)和檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)都不出現(xiàn)紫紅色線(xiàn);或僅檢測(cè)線(xiàn)區(qū)(T)出現(xiàn)紫紅色線(xiàn)。

3 結(jié)果

應(yīng)用豬瘟抗原金標(biāo)檢測(cè)卡共檢測(cè)病豬樣本134頭份,總陽(yáng)性率為67.16%(90/134);其中哺乳仔豬陽(yáng)性率21.74%(5/23);斷奶豬陽(yáng)性率77.53%(69/89);母豬陽(yáng)性率72.72%(16/22)。檢測(cè)臨床癥狀和病理變化較典型的疑似豬瘟病例樣本55頭份,陽(yáng)性符合率為89.10%(49/55);檢測(cè)臨床癥狀和病理變化不典型或無(wú)名高熱病豬樣本79頭份,陽(yáng)性檢出率為51.90%(41/79),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 豬瘟病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果

4 小結(jié)及討論

檢測(cè)結(jié)果顯示,哺乳仔豬的豬瘟病毒陽(yáng)性率最低,這可能與哺乳仔豬受母源抗體的保護(hù)以及與外界環(huán)境接觸時(shí)間相對(duì)較短有關(guān)。斷奶豬的豬瘟病毒陽(yáng)性率最高,可能是由于斷奶后的豬失去母源抗體的保護(hù),有些豬尚未及時(shí)接種豬瘟疫苗,或已接種疫苗,但因各種原因豬體免疫力不強(qiáng),加之此時(shí)正值仔豬出售、販運(yùn)高峰,從而增加了豬感染豬瘟病毒的可能。母豬的豬瘟病毒抗原陽(yáng)性率也比較高,可能是由于近來(lái)仔豬市場(chǎng)價(jià)格上漲,這些豬多是農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)新留的母豬,疫苗注射率較低;或者是經(jīng)產(chǎn)母豬,但近年未加強(qiáng)免疫;而且病豬多是在發(fā)病后經(jīng)多方治療未有明顯效果的情況下來(lái)我院就診的,感染豬瘟病毒的可能性增大。近年來(lái),豬的高熱病發(fā)病率較高,據(jù)報(bào)道有高致病性藍(lán)耳病、附紅細(xì)胞體病、豬瘟、無(wú)名高熱等[3]。此外,豬鏈球菌病、弓形體病、圓環(huán)病毒感染、豬肺疫、傳染性胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌病等也時(shí)有發(fā)生。這些疾病的某些癥狀和部分病變與豬瘟有相似之處,臨床上容易造成誤診。檢測(cè)結(jié)果顯示,豬瘟仍然是當(dāng)?shù)刎i的重要疾病之一,所以必須十分重視豬瘟的防制。

我們應(yīng)用豬瘟病毒抗原金標(biāo)卡檢測(cè)臨床癥狀和病理變化較典型的疑似豬瘟病例,二者陽(yáng)性符合率為89.09%,結(jié)果證實(shí)該金標(biāo)檢測(cè)卡在豬瘟的快速診斷中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用豬瘟病毒抗原金標(biāo)檢測(cè)卡,極大的方便了豬瘟的診斷,取得了明顯的效果。

[1]許保疆,郭成留.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動(dòng)物疫病診斷上的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(3)：48-51.

[2]陳龍賓,王愛(ài)華,蘇小庚,等.豬瘟病毒膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(6)：496-499.

[3]鄧銜柏,廖明,李玉谷,等.我國(guó)南方部分豬場(chǎng)發(fā)生高熱病的疫情調(diào)查初報(bào)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(9)：40-41.