HPLC法測(cè)定山奈酚胃漂浮緩釋片中主藥含量Δ

錢一鑫，康冀川，文庭池，何，何軍(.貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴陽市55005；.貴州師范學(xué)院，貴陽市55008)

近年來，中藥及其活性成分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究已成為生物醫(yī)學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一[1，2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]表明，天然黃酮醇山奈酚(Kaempferol)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，特別是對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用方面近年來已取得較多的進(jìn)展，如:山奈酚可通過下調(diào)凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移作用；山奈酚的攝入能夠降低西班牙人胃癌的發(fā)病率[4]等。山奈酚胃漂浮緩釋片是由山奈酚與適宜藥用輔料制成的親水凝膠型緩釋胃漂浮片，是針對(duì)胃癌治療而新開發(fā)的靶向制劑，該制劑可延長藥物在胃內(nèi)的滯留時(shí)間，減少給藥次數(shù)，延長山奈酚的吸收，提高生物利用度和治療胃癌的靶向性。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品療效，本文選用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)制劑中山奈酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，建立了分離效果好、簡便可行的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明其可用于本品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀，包括G1310A泵、G1316A柱溫箱、G1314A紫外檢測(cè)器、HPCORE工作站(美國Agilent公司)。

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110861-20080，含量:95.9%)；山奈酚原料藥(貴州省生化工程中心，批號(hào):20080311，含量:98.7%)；山奈酚胃漂浮緩釋片(貴州省生化工程中心，批號(hào):20080801、20080803、20080805，規(guī)格:每片25 mg)；甲醇為色譜純，醋酸為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-0.4%醋酸溶液(48∶52)；檢測(cè)波長:360 nm；流速:0.8 mL·min－1；柱溫:45℃；進(jìn)樣量:20 μL。取“2.2”、“2.3”、“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品、供試品、空白輔料溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果空白輔料對(duì)主藥測(cè)定無干擾。色譜見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇振搖超聲溶解，冷卻后定容，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1的貯備液。精密量取貯備液2 mL置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得含山奈酚為20 μg·mL－1的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20片，研細(xì)，取細(xì)粉適量(相當(dāng)于山奈酚10 mg)，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加甲醇80 mL，超聲處理10 min使藥物溶解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 空白輔料溶液的制備

按樣品的處方稱取相當(dāng)于10 mg山奈酚的輔料，置于100 mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法制成空白輔料溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋并定容，搖勻，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰，以峰面積(A)對(duì)其濃度(C，μg·mL－1)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果回歸方程為A＝19.705C+31.598(r＝0.9997)。結(jié)果表明，山奈酚檢測(cè)濃度線性范圍為5.0～40.0 μg·mL－1。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液(20.0 μg·mL－1)于室溫、陽光不直射的情況下放置，每隔2 h分別精密量取20 μL進(jìn)樣測(cè)定1次，共測(cè)定6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD＝2.0%，表明溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)20080801)6份，分別按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量，結(jié)果樣品平均標(biāo)示量為100.30%，RSD＝1.77%，表明本方法的精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取山奈酚原料藥，加入處方比例的輔料，用甲醇溶解，超聲處理10 min，再加甲醇稀釋至刻度，濃度范圍為含量測(cè)定濃度的80%、100%、120%，每個(gè)濃度制備3份，過濾。取續(xù)濾液按“2.9”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)Tab 1Results of recovery test(n＝9)

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取山奈酚胃漂浮緩釋片3批各20片(批號(hào):20080801、20080803、20080805)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜；另取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2Content determination of samples

3 討論

山奈酚胃漂浮緩釋片是貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心開發(fā)研究的抗胃癌新制劑，目前該產(chǎn)品尚未上市，故對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行充分的研究，將對(duì)制劑品種的穩(wěn)定性和上市產(chǎn)品后質(zhì)量監(jiān)控具有十分重要的意義。試驗(yàn)中測(cè)定的山奈酚胃漂浮緩釋片的凝膠骨架材料為羥丙甲基纖維素和海藻酸鈉，這2種輔料均不干擾主藥的測(cè)定。

本文通過方法學(xué)考察建立了測(cè)定山奈酚胃漂浮緩釋片含量的HPLC法，結(jié)果表明，本方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，不但可用于控制山奈酚胃漂浮緩釋片的質(zhì)量，也可用于山奈酚其它制劑的質(zhì)量控制和分析。

[1]馬慧萍，謝景文.中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2001，12(4):242.

[2]王艷艷，王威，李紅巖.中藥有效成分抗胃癌作用研究進(jìn)展[J].中國藥房，2007，18(30):2383.

[3]劉彥芳.山奈素對(duì)裸鼠原位種植人胃癌組織ki67和bcl-2表達(dá)的影響[D].第二軍醫(yī)大學(xué)，2005:38.

[4]Reina GC，Carlos AG，Antonio A，et al.In take of specific carotenoids and flavonoids and the risk of gastric cancer in Spain[J].Cancer Causes and Control，1999，10(1):71.