羥苯磺酸鈣膠囊微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證研究

王瑋，陶俊鈺(安徽巢湖市藥品檢驗(yàn)所，巢湖市238000)

羥苯磺酸鈣膠囊是一種改善微循環(huán)的新藥，特別在治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變方面是唯一的成熟產(chǎn)品，在心肌梗死、靜脈不適及血管保護(hù)、血栓形成等病癥方面有著較好的臨床作用，有一定的抗炎作用[1]。由于其可能具有一定抗菌作用，因此必須以適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛞种浦苿┲械目刮⑸锘钚院螅拍苓M(jìn)行其微生物限度的檢查。通過(guò)研究，筆者對(duì)霉菌和酵母菌采用常規(guī)法；對(duì)細(xì)菌采用薄膜過(guò)濾法，沖洗量為200 mL，每次100 mL；對(duì)控制菌采用常規(guī)法，建立了該制劑的微生物限度檢查法并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，以確定該藥品所采用微生物限度檢查方法的有效可行。

1 材料

1.1 儀器

凈化工作臺(tái)、托盤天平、HTY-ⅢA集菌儀、開放式薄膜過(guò)濾器(杭州高德泰林有限公司)；BIO-Ⅱ-A2生物安全柜(上海振梓空氣凈化設(shè)備有限公司)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)；YQL-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基、稀釋劑(pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，稀釋供試品用)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 試藥

羥苯磺酸鈣膠囊(上海海虹(實(shí)業(yè))集團(tuán)巢湖中辰藥業(yè)有限公司，批號(hào):071107、071108、071109，規(guī)格:每粒0.25 g)。

1.4 試驗(yàn)菌

大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄ⅪJ有關(guān)微生物檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[2，3]。

2.1 菌液的制備

①取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～l0－7，使成50～100 cfu·mL－1，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。②取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－6，使成50～100 cfu·mL－1，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。③取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5 mL洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液適量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)?shù)逆咦討乙?，取此孢子懸? mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－7，使成50～100 cfu·mL－1，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。

2.2 供試液制備

取10 g供試品，加入45℃的pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，作為1∶10倍的供試液備用。

2.3 常規(guī)法

2.3.1 試驗(yàn)組。取1∶10倍供試液1 mL和1 mL已制備好的菌液，注入同一平皿，迅速倒入15～20 mL 45℃左右的相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每個(gè)菌株制備2個(gè)平皿。細(xì)菌在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；霉菌在23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取均值。

2.3.2 菌液組。分別取菌液1 mL注入平皿內(nèi)，每種菌平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組。同試驗(yàn)組方法，不加菌液，測(cè)定供試品菌數(shù)(本底菌)。

2.3.4 回收率測(cè)定。按公式:試驗(yàn)組的菌回收率(%)＝(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)×100%(以下同)，計(jì)算回收率常規(guī)法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)法的回收率試驗(yàn)結(jié)果(%，n＝5)Tab 1Recovery test results of routine method(%，n＝5)

從表1結(jié)果看，采用常規(guī)法檢查供試品，人工污染5種菌株，金黃色葡萄球菌回收率小于70%，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率不能滿足3次獨(dú)立試驗(yàn)都大于70%的要求，因此常規(guī)法不能用于細(xì)菌檢查。另外，在3次獨(dú)立的試驗(yàn)中，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%，因此可以采用常規(guī)法對(duì)該藥品的霉菌和酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢查。

2.4 培養(yǎng)基稀釋法

2.4.1 試驗(yàn)組。取1∶10倍供試液每皿0.5、0.2、0.1 mL，分別與已制備好的1 mL細(xì)菌菌液注入同一平皿，迅速倒入15～20 mL 45℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每個(gè)菌株制備2個(gè)平皿，倒置在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取均值。

2.4.2 菌液組。方法同“2.3.2”項(xiàng)下。

2.4.3 供試品對(duì)照組。同試驗(yàn)組方法，不加菌液，測(cè)定供試品菌數(shù)(本底菌)。

2.4.4 回收率測(cè)定。方法同“2.3.4”項(xiàng)下，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)Tab 2Recovery test results of dilution method(%)

由表2可知，通過(guò)培養(yǎng)基將供試品吸收后，可消除本品對(duì)大腸埃希菌的抑制作用，使其回收率均達(dá)到70%以上，但金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率還是不能滿足要求。

2.5 薄膜過(guò)濾法

2.5.1 試驗(yàn)組。取1∶10的供試液1 mL，加入到無(wú)菌開放式薄膜過(guò)濾器中，分別用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100、200 mL，每次50 mL進(jìn)行沖洗。在最后一次沖洗液中分別加入已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌1 mL，過(guò)濾，取出薄膜貼于瓊脂培養(yǎng)基上，平行制備2張膜。

2.5.2 菌液組。分別取上述制備的菌液1 mL注入無(wú)菌開放式薄膜過(guò)濾器內(nèi)過(guò)濾，貼膜，每種菌平行制備2張濾膜，分別測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.5.3 供試品對(duì)照組。同試驗(yàn)組方法，不加菌液，測(cè)定供試品菌數(shù)(本底菌)。

2.5.4 回收率測(cè)定。方法同“2.3.4”項(xiàng)下，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3結(jié)果看，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量200 mL)檢查供試品，人工污染3種細(xì)菌菌株，3次平行試驗(yàn)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的回收率均大于70%，可用于供試品細(xì)菌檢查。

表3 薄膜過(guò)濾法回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)Tab 3Recovery test results of membrane filtration method(%)

2.6 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法的驗(yàn)證[4]

2.6.1 供試液的制備。同“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液的制備。

2.6.2 試驗(yàn)組。取3批1∶10的供試液10 mL和大腸埃希菌懸液1 mL(約為50～100 cfu·mL－1)接種至100 mL BL培養(yǎng)基中，置于35℃培養(yǎng)18～24 h，取0.2 mL接種至5 mL MUG培養(yǎng)基管內(nèi)，35℃培養(yǎng)5、24 h，置于366 nm紫外光下觀察熒光，沿培養(yǎng)管管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察結(jié)果。

2.6.3 陰性菌對(duì)照組。取金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌，方法同“2.6.2”項(xiàng)。

2.6.4 陰性對(duì)照組。取稀釋劑10 mL取代供試液，其余同試驗(yàn)組操作。

2.6.5 陽(yáng)性對(duì)照組。不加供試液，其余同試驗(yàn)組操作。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大腸埃希菌控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4Validation test of Escherichia coli

從表4結(jié)果看，陰性對(duì)照未檢出大腸埃希菌，陽(yáng)性對(duì)照檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌，試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，說(shuō)明可以采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，羥苯磺酸鈣膠囊可采用薄膜過(guò)濾法、沖洗量為200 mL進(jìn)行細(xì)菌數(shù)檢查，霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌(大腸埃希菌)可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響:(1)沖洗液溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。本品細(xì)菌數(shù)檢查采用薄膜過(guò)濾法，沖洗液的溫度控制在45℃時(shí)，可以增加供試液的濾過(guò)性，降低抗菌活性。沖洗液的溫度小于45℃時(shí)，藥物及其輔料不能充分溶解，堵塞薄膜，供試液的濾過(guò)性降低，不利于消除該藥物的抗菌活性；沖洗液的溫度大于45℃時(shí)容易傷害藥品中污染的雜菌，影響檢測(cè)結(jié)果。(2)培養(yǎng)基溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。本品霉菌數(shù)檢查采用常規(guī)法，培養(yǎng)基注入平皿中時(shí)應(yīng)控制溫度在45℃，高于45℃時(shí)易造成微生物受損或死亡，＜45℃時(shí)則培養(yǎng)基易凝固。

采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，先加入少量稀釋劑適當(dāng)浸泡濾膜，可減少濾膜對(duì)藥物的吸附，利于對(duì)藥物抑菌因子的沖洗。

[1]孫素馨，王宏，孫曉芹.羥苯磺酸鈣的藥理及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(2):100.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄93.

[3]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].2005年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:6.

[4]王海華，韋濤.阿咖酚散微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].中國(guó)藥房，2008，19(28):2222.