HPLC法測(cè)定人血漿中雙嘧達(dá)莫的濃度

李曉苗，李源，謝永宏（1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安市7100；.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉科，西安市 7100；.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸科，西安市 71008）

雙嘧達(dá)莫又名潘生丁，因其具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈及抗血小板聚集功能，臨床主要用于預(yù)防和治療心絞痛、心肌梗死和血栓栓塞性疾病[1，2]。隨著雙嘧達(dá)莫在臨床的廣泛應(yīng)用，對(duì)其研究也不斷增多，筆者建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的高效液相色譜法測(cè)定雙嘧達(dá)莫的血藥濃度，可用于雙嘧達(dá)莫臨床血藥濃度測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)、生物等效性的研究。

1 材料

1.1 儀器

10A series高效液相色譜儀，包括LC-10Avp二元泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、Class-VP工作站（日本島津公司）；TG16-WS高、低速離心機(jī)（上海滬湘儀器有限公司）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99%）；內(nèi)標(biāo)：地西泮注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL∶10 mg，批號(hào)：070102）；乙腈為色譜純，三乙胺、冰醋酸、醋酸銨均為分析純；所有試驗(yàn)用水均為雙重蒸餾水；空白血漿由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（50 mm×4.6 mm，5 μm），ODS預(yù)柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.02 mol·L－1醋酸銨（含0.25%三乙胺，冰醋酸調(diào)pH值至5.6）＝40∶60；流速：1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入適量甲醇使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為500 μg·mL－1的雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)貯備液。將該貯備液以甲醇稀釋，制備成濃度分別為0.4、1.0、2.0、5.0、10、20、40、100、200 μg·mL－1的雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密量取地西泮注射液1 mL，置于50 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得濃度為100 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.4 血漿樣品的處理

量取空白血漿0.4 mL，置于10 mL具塞離心管中，加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉（NaOH）溶液 0.5 mL，渦旋混合30 s后加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混合30 s。加入乙醚3 mL渦旋混合3 min，4 500 r·min－1離心10 min。分離有機(jī)層，室溫下N2吹干。殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相100 μL渦旋混合30 s使之溶解，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

量取空白血漿0.4 mL，置于10 mL具塞離心管中，分別加入不同濃度雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，混勻，使其血藥濃度分別為10、25、50、125、250、500、1 000、2 500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”項(xiàng)下方法操作測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3次，取平均值。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，雙嘧達(dá)莫與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.006+0.036X（r＝0.999 0），結(jié)果表明，雙嘧達(dá)莫血藥濃度在10～5 000 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。血漿中雙嘧達(dá)莫的定量下限為10 ng·mL－1。

2.6 方法專屬性考察

在本色譜條件下，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定，并且峰形良好。雙嘧達(dá)莫、內(nèi)標(biāo)地西泮保留時(shí)間分別約為8、17 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.空白血漿+雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)；1.雙嘧達(dá)莫；2.地西泮Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+diazepam；C.blank plasma+dipyridamole control+diazepam；1.dipyridamole；2.diazepam

2.7 回收率試驗(yàn)

分別在0.4 mL空白血漿中加入低、中、高3種濃度的雙嘧達(dá)莫標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，混勻，使其血藥濃度分別相當(dāng)于25、500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，將雙嘧達(dá)莫峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙嘧達(dá)莫血藥濃度，并以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算方法回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。另以流動(dòng)相配制相應(yīng)系列濃度的雙嘧達(dá)莫溶液，不經(jīng)提取直接測(cè)定，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將2組峰面積相比，計(jì)算得雙嘧達(dá)莫提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery test（n＝5）

2.8 精密度試驗(yàn)

同“2.7”項(xiàng)下方法制備，使血漿中雙嘧達(dá)莫溶液濃度分別為25、500、5 000 ng·mL－1，每個(gè)濃度平行制備5份樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作。進(jìn)樣分析計(jì)算日內(nèi)精密度；依上述方法，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 穩(wěn)定性考察

同“2.7”項(xiàng)下方法制備，使血漿中雙嘧達(dá)莫溶液濃度分別為25、500、5 000 μg·mL－1，于－20 ℃冷凍保存，反復(fù)凍融3次，分別按“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定血漿中雙嘧達(dá)莫濃度，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明血漿中雙嘧達(dá)莫在－20℃冷凍保存，反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性符合要求（RSD均＜6%）。同“2.7”項(xiàng)下方法制備上述3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后分別于0、6、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明處理后的血漿中雙嘧達(dá)莫在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（RSD均＜6%）。同“2.7”項(xiàng)下方法制備上述3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿，分別于0、6、24 h時(shí)按“2.4”項(xiàng)下方法處理標(biāo)準(zhǔn)血漿，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明室溫下血漿樣品穩(wěn)定性良好（RSD均＜4%）。

3 討論

在選擇流動(dòng)相時(shí)，分別選用了甲醇-磷酸二氫鈉、乙腈-磷酸二氫鈉、甲醇-醋酸銨、乙腈-醋酸銨，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)選用乙腈-醋酸銨時(shí)峰形較好，與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)、內(nèi)標(biāo)可完全分離，分離度大于2，且保留時(shí)間適宜。

本試驗(yàn)篩選了大量的內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol·L－1醋酸銨（含0.25%三乙胺，冰醋酸調(diào)pH值至5.6）時(shí)，選用地西泮為內(nèi)標(biāo)與雙嘧達(dá)莫的分離度最好，保留時(shí)間適宜。

對(duì)于雙嘧達(dá)莫的提取方法，分別選用乙醚、乙酸乙酯、氯仿為提取劑，經(jīng)過(guò)比較，乙醚提取率較高，且雜質(zhì)較少，峰形較好，易于N2吹干；乙酸乙酯和氯仿提取回收率較低，雜質(zhì)較多，不易于N2吹干，比較耗時(shí)。同時(shí)考察了乙醚的用量對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)乙醚用量為3 mL時(shí)比1.5 mL提取率高，而與5 mL相比無(wú)顯著性差異。因此將乙醚定量為3 mL。本法使用乙醚1次提取即可使回收率達(dá)85%以上，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間。在提取過(guò)程中，將樣品分別振蕩1、3、5 min，結(jié)果表明，振蕩3 min提取率高于1 min，與5 min相比無(wú)顯著性差異。

本文建立的高效液相色譜法測(cè)定雙嘧達(dá)莫血藥濃度準(zhǔn)確、靈敏、特異、穩(wěn)定，適用于雙嘧達(dá)莫在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和生物利用度研究。

[1]陳新謙，金有豫，湯 光主編.新編藥物學(xué)[M].第15版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：268.

[2]Julie H，Robert AO.Drugs used in disorders of coagulation[A].Katzung BG.Basic&Clonical Pharmacology[M].8th edn.Beijing：The McGraw-Hill Companies，2001：564.