一株DBP高效降解菌的篩選及其降解特性

金德才，梁任星，王洋洋，代沁蕓，張瑞永，吳學(xué)玲

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙，410083)

PAEs類化合物是人工合成的難降解有機物，被廣泛用作農(nóng)藥、驅(qū)蟲劑、化妝品、潤滑劑以及去污劑的生產(chǎn)原料，相對分子質(zhì)量較高的 PAEs也被廣泛用作塑料增強劑和改性劑，其用量僅比塑料中的多聚物用量低。由于 PAEs在塑料制品的生產(chǎn)、使用等過程中很容易釋放出來，該類化合物已成為一種全球性的環(huán)境有機污染物，在土壤、水體、大氣、生物甚至人體中都已發(fā)現(xiàn)PAEs的分布[1]。大量研究表明：酞酸酯為一種具有致畸、致癌、致突變“三致效應(yīng)”的環(huán)境干擾劑[2-3]。美國環(huán)保局(EPA)、歐盟委員會和中國環(huán)境監(jiān)測總站均把此類化合物列為優(yōu)先污染物黑名單[4]。在自然環(huán)境中，鄰苯二甲酸酯類化合物的降解主要有2種途徑：生物降解和非生物降解。非生物降解主要為水解和光解。研究表明，鄰苯二甲酸酯的水解和光解非常緩慢，微生物降解是其礦化的主要途徑[5]。為提高鄰苯二甲酸酯類有機污染物的生物降解效率，篩選高效專性或兼性的降解菌非常必要。DBP作為一種重要的 PAEs化合物，因其在工業(yè)上普遍應(yīng)用且在環(huán)境中大量存在而成為重要的研究對象。在此，本文作者分離到一株能夠以DBP為唯一碳源生長的細菌。降解實驗表明：此菌是一株高效降解菌，在持久性有機污染物處理中具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和器材

主要試劑為：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)；鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)；鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)；鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)；鄰苯二甲酸二異辛酯(DIOP)(購自中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司，含量≥99.5%)；甲醇(分析純)和乙酸乙酯(分析純)(由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn))；色譜級甲醇(購自美國sigma公司)。

主要器材為：725N型紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；Elite高效液相色譜儀(大連伊利特公司生產(chǎn))。

1.2 樣品來源及菌株篩選

采樣地為山西省平定縣有機場污水底泥。

從樣品中稱10 mg污泥置于含200 mg/L 鄰苯二甲酸酯(DMP，DEP，DBP和DOP各為50 mg/L)的100 mL無機鹽培養(yǎng)液中，采用梯度壓力法馴化，在30 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，逐步轉(zhuǎn)接至含240，280，320，360和400 mg/L鄰苯二甲酸酯的無機鹽培養(yǎng)液后，用接種針蘸取少量菌液，在 PAEs固體平板上劃線，選擇菌落較大、形態(tài)和顏色各異的菌落轉(zhuǎn)接到新的固體培養(yǎng)基上劃線。重復(fù)5次后，挑取單菌落重新接到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

無機鹽培養(yǎng)基組成(g/L)為：K2HPO45.8，KH2PO44.5，(NH4)2SO42.0，MgCl20.16，CaCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.002 4，F(xiàn)eCl30.001 8，MnCl2·2H2O 0.001 5；pH調(diào)至7.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。在每1 L固體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

富集培養(yǎng)基組成(g/L)為：牛肉膏 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0；水1 L，pH=7.0。培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min。在每1 L固體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

l.3 細菌生理生化特性測定

生理生化鑒定參考文獻[6-7]進行。

1.4 細菌底物廣譜性測試

在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入溶于氯仿后抽濾滅菌的萘(200 mg/L)、二苯胺(200 mg/L)、鄰苯二酚(200 mg/L)、甲苯(200 mg/L)；將鄰苯二甲酸(200 mg/L)、水楊酸(200 mg/L)以及 DMP(200 mg/L)，DBP(200 mg/L)，DEP(200 mg/L)，DIOP(200 mg/L)和原兒茶酸(200 mg/L)直接加入無機鹽培養(yǎng)基中采用常規(guī)濕熱滅菌。

1.5 細菌的16S rDNA 的擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在50 μL 反應(yīng)體系中，含有：10×PCR buffer 5 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；25 mmol/L MgCl24 μL；Taq 酶0.5 μL；5 μmol/L 引 物(正 向 引 物 FC27為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′； 反 向 引 物RC1492 為 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL；DNA模板4 μL；其余成分為ddH2O。PCR擴增程序參考文獻[8]進行。取全部反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳。用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(OMEGA)進行膠回收，PCR純化產(chǎn)物的測序工作由上海生工公司完成。用 Clustalx1.8軟件進行全序列比對，并用MEGA3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.6 DBP的生物降解試驗

取菌株于 100 mL活化富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～24 h，離心(轉(zhuǎn)速為10 000 r/min) 5 min，收集菌體，用pH=7.0，濃度為0.02 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌3次，用0.02 mol/ L 磷酸緩沖液將菌體配成pH=7.0，波長為600 nm時的光密度OD600=0.2的菌懸液，吸取1 mL菌懸液于含1 g/ L DBP的50 mL無機鹽培養(yǎng)液中，根據(jù)不同條件進行培養(yǎng)。

1.7 分析方法

1.7.1 樣品處理

于試樣瓶中加入20 mL乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，收集有機相，水相再用20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，待蒸發(fā)后用甲醇定容至10 mL，用高效液相色譜儀測定DBP的殘留量。

1.7.2 液相色譜條件

色譜柱為SinoChrom ODS-BP (4.6 mm×200 mm×5 μm)，柱溫 35 ℃，V(流動相甲醇)∶V(水)= 9∶1，流速為0.5 mL/min。檢測器波長為228 nm，進樣量為20 μL。

1.7.3 生物量測定

為測定菌株 JDC-11的生物量，采用 725N 型紫外可見分光光度計在600 nm時測量培養(yǎng)基的光密度OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JDC-11的分離與部分生理生化測定

土壤樣品經(jīng)過10次以上轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，搖瓶中的混合培養(yǎng)物能夠在 400 mg/L鄰苯二甲酸酯的無機鹽培養(yǎng)液中很好地生長，說明降解菌株在此過程中被富集。搖瓶中的混合培養(yǎng)物通過在含有鄰苯二甲酸酯的平板上進行劃線分離，經(jīng)過復(fù)篩、純化后篩選得到一株能以 DBP為唯一碳源生長的菌株，命名為 JDC-11。JDC-11菌株在LB平板上于30 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后，菌落呈白色、不規(guī)則、微凸、濕潤、不透明，不產(chǎn)生色素，無芽孢。在顯微鏡下觀察，細胞初期至后期一直為球狀，直徑為0.71～1.18 μm。JDC-11菌株的電鏡照片如圖1所示，其部分生理生化特征見表1。

2.2 底物廣譜性實驗

接種培養(yǎng)7 d后觀察，重復(fù)3次，結(jié)果如表2所示?？梢姡篔DC-11可以很好地利用簡單的鄰苯二甲酸酯類化合物，鄰苯二甲酸酯類化合物的生物降解隨著烷基鏈含碳數(shù)的增加和分枝側(cè)鏈的增加而降低，這與文獻[10]中的結(jié)果一致。JDC-11還可以利用鄰苯二甲酸酯類化合物的中間代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸、原兒茶酸等和芳烴類化合物中間代謝產(chǎn)物鄰苯二酚，預(yù)示著JDC-11在實際污染物處理中具有重要的價值。

圖1 菌株JDC-11的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM image of strain JDC-11

表1 JDC-11菌株的部分生理生化特征Table 1 Biophysical and biochemical characteristics of strain JDC-11

表2 PAEs降解菌株JDC-11的底物廣譜性Table 2 Diversity of degradable substrates by strain JDC-11

2.3 菌株JDC-11的16S rDNA分析

采用PCR技術(shù)，擴增出16S rDNA基因，測序的序列長度為1 418 bp，在GenBank中的序列登錄號為FJ378037。 以Nocardia abscessusstrain ATCC BAA-279為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。JDC-11與Rhodococcussp. D2-6(AM403174)的親緣關(guān)系最近，相似度為99%，基本可以判定JDC-11屬于紅球菌屬。

2.4 培養(yǎng)條件對菌株生長和DBP降解的影響

2.4.1 初始pH值對菌株JDC-11生長及DBP降解率的影響

在溫度為30 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速為175 r/min時，考察pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0時DBP作為單一基質(zhì)情況下的生物降解的情況，24 h測定的實驗結(jié)果如圖3所示。

圖2 JDC-11菌株的16S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of JDC-11 and sequences of relating species

圖3 初始pH值對菌株JDC-11生長及DBP降解的影響Fig.3 Effects of pH value on biomass and DBP biodegradation

研究結(jié)果表明：在 pH 值為 5.0～11.0時，菌株JDC-11 OD600隨初始pH值升高先增加，在初始pH值為8.0時OD600最大，但隨著pH值的繼續(xù)升高，OD600卻隨之減少；當(dāng)初始pH值超過10.0時，OD600顯著減少，菌株幾乎不能生長。DBP的殘留率也隨著初始pH值的升高而降低，在初始pH值為8.0時檢測不到DBP，已完全降解，并且與菌株的生長量有很好的相關(guān)性，在pH值為7.0～9.0時均可以保持較高的降解率。由此可見，該菌株較適合在偏堿性的條件下生長。初始pH值為8.0是細胞生長和DBP降解的最佳pH值，在此條件下細菌的降解酶系可以保持在一個高活力的狀態(tài)，在初始 pH過高或過低的情況下，無論是細菌生長量還是DBP的殘留率都明顯地受到影響。

2.4.2 溫度對菌株JDC-11生長及DBP降解率的影響

在pH值為8.0、搖瓶轉(zhuǎn)速為175 r/min時，考察在20，25，30，35，40和45 ℃時，DBP作為單一基質(zhì)情況下的生物降解的情況，24 h后測定的試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 初始溫度對菌株JDC-11生長及DBP降解的影響Fig.4 Effect of temperature on biomass and DBP biodegradation

結(jié)果表明：在 20～45 ℃時，OD600隨初始溫度升高先增加，在溫度為30 ℃時，OD600最大，檢測不到DBP；但隨著溫度的繼續(xù)升高，OD600隨之減少，當(dāng)初始溫度超過35 ℃時，OD600顯著減少，菌株幾乎不能生長。由此可見，該菌株較適合在 30 ℃左右條件下生長。而在溫度過低或過高都會抑制JDC-11的生長，影響DBP的降解。

2.4.3 轉(zhuǎn)速對菌株JDC-11生長及DBP降解率的影響

在溫度為30 ℃、pH值為8.0的條件下，考察轉(zhuǎn)速為0，75，125，175和225 r/min時，DBP作為單一基質(zhì)情況下的生物降解的情況，試驗結(jié)果如圖 5所示。

圖5 轉(zhuǎn)速對菌株JDC-11生長和DBP降解的影響Fig.5 Effect of agitation rate on biomass and DBP biodegradation

由圖5可知：在靜止條件下，菌株JDC-11仍然顯示出對DBP較強的降解能力，殘留率僅為42.6%；當(dāng)轉(zhuǎn)速為175 r/min時，檢測不到殘留DBP。因此，轉(zhuǎn)速為175 r/min是菌株JDC-11生長的最佳轉(zhuǎn)速條件。

2.4.4 培養(yǎng)時間對菌株JDC-11生長及DBP降解率的影響

在溫度為 30 ℃、pH值為 8.0、搖瓶轉(zhuǎn)速為 175 r/min的條件下，考察間隔4 h，DBP作為單一基質(zhì)情況下的生物降解的情況，試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時間對菌株JDC-11生長及DBP降解的影響Fig.6 Effect of incubation time on biomass and DBP biodegradation

從圖6可以看出：JDC-11基本不存在前滯期，能夠很快進入快速利用DBP的狀態(tài)，24 h后幾乎檢測不到DBP。

2.4.5 葡萄糖對菌株JDC-11降解DBP的影響

葡萄糖是一種容易降解的有機物，考察在有葡萄糖存在的條件下的生物降解，可以大體上作為環(huán)境中有天然有機物存在條件下生物降解情況的一種代表。

在溫度為 30 ℃、pH值為 8.0、搖瓶轉(zhuǎn)速為 175 r/min條件下，葡萄糖質(zhì)量濃度為0，200，400，600，800，1 000和1 200 mg/L時的生物降解情況如圖7所示。

圖7 葡萄糖質(zhì)量濃度對DBP降解的影響Fig.7 Effect of glucose concentration on DBP biodegradation

從圖7可以看出：當(dāng)環(huán)境中存在一定質(zhì)量濃度的葡萄糖時，對DBP的生物降解的影響很大。這些影響主要表現(xiàn)在以下2個方面：(1) 在前12 h，所有質(zhì)量濃度的葡萄糖對DBP的降解都起到了抑制作用，在未加葡萄糖的體系中，12 h殘留率為30%，在加葡萄糖的體系中，12 h殘留率為40%～50%；(2) 12 h后，除了加200 mg/L葡萄糖的體系對DBP的降解起抑制作用外，其他質(zhì)量濃度的葡萄糖體系都對DBP的降解起促進作用。

由此可見，葡萄糖對DBP降解的影響不僅與葡萄糖質(zhì)量濃度有關(guān)，而且與培養(yǎng)時間有關(guān)?？傮w上說，低質(zhì)量濃度葡萄糖抑制了DBP的降解，高質(zhì)量濃度的葡萄糖會使DBP降解周期縮短。

3 討論

Rhodococcussp.是一類廣泛分布于自然環(huán)境中的好氧、不運動、高GC含量的革蘭氏陽性菌。該類微生物能夠降解多種有機污染物，因而在各類環(huán)境污染物的生物修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。就 PAEs這類環(huán)境污染物而言，國內(nèi)外學(xué)者對Rhodococcussp.在降解該類化合物中的作用及代謝途徑都進行了相關(guān)的研究。如：Jackson等[11]報道Rhodococc-ussp. 能夠降解對苯二甲酸二乙酯(DETP)；Kurane等[12]的研究表明，在活性污泥中，R.erytropolisS1能在3～5 d內(nèi)完全降解DEHP。近幾年來，Rhodococcussp.在降解PAEs類化合物以及在生物修復(fù)中的作用也有不少報道[13-16]。此外，李魁曉等[17]從紅樹林中分離到Rhodococcus rubber.1K，降解試驗表明：該菌能以 DBP為唯一碳源和能源生長，可在48 h內(nèi)將50 mg/L DBP及其中間產(chǎn)物完全降解。Li等[18]從垃圾填埋場的土壤中分離到一株降解DBP的細菌Rhodococcus rubberCQ0302，并開展了該菌的降解動力學(xué)及在生物修復(fù)方面的研究。綜上所述，Rhodococcussp.在PAEs及其他環(huán)境污染物的降解中起著重要的作用。本文作者從污染土壤樣品中分離到一株能夠利用 DBP作為唯一碳源和能源生長的細菌JDC-11，經(jīng)過對其形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)JDC-11與Rhodococcussp.D2-6 (AM403174)的親緣關(guān)系最近，相似度為99%，該菌株初步鑒定為Rhodococcussp。降解試驗表明，菌株JDC-11降解DBP的最佳條件是：溫度為30 ℃，pH值為8.0。這與文獻[18]報道的Rhodococcus ruberCQ0302的最佳降解條件基本一致。在此最佳降解條件下，初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的DBP，經(jīng)過24 h培養(yǎng)，降解率可達100%。初始質(zhì)量濃度為100 mg/L的DBP在不同紅球菌菌株的作用下要1～3 d才能完全降解[15]。李魁曉等[17]分離的Rhodococcus ruber1K也要在48 h內(nèi)將50 mg/L的DBP及其中間產(chǎn)物完全降解。本研究分離的JDC-11是一株降解DBP的高效菌，在處理含有鄰苯二甲酸酯類化合物污染的生物修復(fù)方面具有獨特的應(yīng)用潛力。

以往的研究表明：碳源、氮源、磷以及有機鹽等對微生物的生長起著關(guān)鍵的作用。因為它們能夠作為電子受體，從而提高微生物的呼吸速率[19]。在Li等[18]的研究中，為了確定外源加入的營養(yǎng)物質(zhì)對降解速率的影響，把硝酸鉀和蛋白胨加入到污染的土壤中并比較它們的降解速率。結(jié)果表明：通過加入外源的營養(yǎng)物質(zhì)可以提高DBP的降解速率。本研究以葡萄糖為外源營養(yǎng)物質(zhì)，考察葡萄糖質(zhì)量濃度不同時的生物降解情況。結(jié)果表明：葡萄糖對DBP降解的影響不僅與葡萄糖濃度有關(guān)，而且與培養(yǎng)時間也有關(guān)?？傮w上說，低質(zhì)量濃度葡萄糖抑制了DBP的降解，高質(zhì)量濃度的葡萄糖會使DBP降解周期縮短。總之，微生物在降解過程中受很多因素的影響，在應(yīng)用于環(huán)境污染物的生物修復(fù)時需綜合考慮多方面的因素。

4 結(jié)論

(1) 從污染土壤樣品分離到一株能夠利用DBP作為唯一碳源和能源生長的細菌 JDC-11，初步鑒定為Rhodococcussp。

(2) 菌株JDC-11降解 DBP的最適條件是：溫度為30 ℃，pH=8.0，轉(zhuǎn)速為175 r/min。在此條件下，菌株能達到最大 OD600和最高降解率，初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的DBP經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，降解率可達100%，充分證明JDC-11是一株高效降解菌。

(3) 葡萄糖對DBP的生物降解有延長前滯期和加速降解的影響，從到達生物降解終點所需時間看，高質(zhì)量濃度的葡萄糖對于DBP的生物降解起促進作用，低質(zhì)量濃度的葡萄糖則會延緩生物降解速度，對DBP的生物降解有抑制作用。

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