β-catenin/Tcf復(fù)合體 、cyclinD1 、c-myc在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義

林瓊瓊 李錦添

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院,浙江 溫州 325027；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心,廣東 廣州 510060)

Wnt/β-catenin通路是胚胎組織發(fā)育分化所必需的關(guān)鍵信號(hào)通路[1],其多種重要成分已經(jīng)證明在細(xì)胞分化中有明確的作用。該通路主要通過樞紐分子β-catenin從胞漿內(nèi)進(jìn)入核內(nèi)與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)樣因子(Tcf/Lef)結(jié)合成β-catenin/Tcf復(fù)合體起作用,啟動(dòng)下游靶基因cyclinD1、c-myc、cox-2等的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控細(xì)胞發(fā)育分化并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究對(duì)不同分化程度鼻咽癌細(xì)胞株中βcatenin/Tcf復(fù)合體的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)一步研究該通路下游基因cyclinD1和c-myc的表達(dá),對(duì)上述三個(gè)分子和鼻咽癌分化的關(guān)系進(jìn)行研究,為將來通過該通路對(duì)鼻咽癌進(jìn)行靶向治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院2004年1月～2008年12月病理診斷為鼻咽癌的石蠟標(biāo)本79例,其中角化性鱗狀細(xì)胞癌8例,分化型非角化性癌31例,以及未分化癌40例。高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2和HONE-1、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 TOPFLASH和FOPFLASH以及校正轉(zhuǎn)染效率的質(zhì)粒β-gal-CMV均為本實(shí)驗(yàn)室收藏。

1.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)自Invitrogen公司。熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和β-半乳糖苷酶檢測(cè)系統(tǒng)均產(chǎn)自Promega公司。cyclinD1多克隆抗體為Newmarker公司產(chǎn)品,c-myc單克隆抗體(克隆號(hào)9E10)購(gòu)自Santa Cruz公司,免疫組化S-P二步法試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞傳代 以2.5×104細(xì)胞數(shù)在24孔板中生長(zhǎng)至75%～95%面積時(shí)用脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每種細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染TOPFLASH/β-gal和FOPFLASH/β-gal[2]各 0.8 μ g,且每種細(xì)胞轉(zhuǎn)染 3 個(gè)平行孔,并做陰性對(duì)照。按照Promega公司的說明書在48小時(shí)后加入裂解緩沖液并收集細(xì)胞裂解液。在 BIOSCAN公司的單光子儀(LUMI—SCINT TM)上檢測(cè)30秒內(nèi)熒光素酶催化熒光素氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的光強(qiáng)度(Relative Luciferase Unit,RLU)；并在分光光度計(jì)上測(cè)定β-半乳糖苷酶(β-gal)在420nm處吸光值對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每種細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)值(即轉(zhuǎn)錄活性)為3次RLU值和βgal值之比的平均值。

1.3.2 cyclinD1的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)中設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。所用方法為S-P二步法,將切片脫蠟,水化,浸入3%過氧化氫(H2O2)溶液中,室溫下15分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化酶,置于pH6.0的0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液中,以高火5分鐘,中低火20分鐘的條件在微波爐中加熱以修復(fù)抗原,室溫冷卻30分鐘；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌后,滴加cyclinD1多克隆抗體,工作濃度為 1∶35,孵育過夜；PBS洗滌,滴加二抗后孵育并洗滌,滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液,于37℃孵育15分鐘；PBS洗滌,3.3-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染；中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.3.3 c-myc的檢測(cè) 同樣設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,利用S-P二步法,將切片脫蠟,水化,浸入 3%H2O2溶液中,室溫下1小時(shí)以封閉內(nèi)源性過氧化酶；然后置于pH8.0的1 mol/L的EDTA緩沖液中,微波爐加熱修復(fù)抗原,高火5分鐘,中低火20分鐘,并于室溫下冷卻30分鐘；PBS洗滌后用0.01%的Triton-X100處理后放置在室溫下10分鐘,PBS洗滌3次,每次2分鐘后,滴加第一抗體,滴度為1∶30,于4℃孵育過夜；PBS緩沖液中洗滌,分別滴加二抗和鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液,分別于37℃孵育15分鐘；PBS洗滌,DAB顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染；中性封片,顯微鏡下觀察。

1.3.4 結(jié)果判定 cyclinD1和c-myc蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi),觀察各切片鼻咽癌的表達(dá)形式,并參照Carcangiu's[3]的雙記分法對(duì)各蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用卡方檢驗(yàn)和精確概率法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 TOPFLASH-luc和FOPFLASH-luc的表達(dá)高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中,TOPFLASH-Luc值跟FOPFLASH-Luc值之比僅為1.39。低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2和HONE-1中,TOPFLASHLuc值與FOPFLASH-Luc值之比分別為16.35和17.13。CNE-2和HONE-1中TOPFLASH-Luc的表達(dá)值分別是CNE-1的 80.12倍和 123.6倍,FOPFLASH-Luc的表達(dá)值分別是CNE-1的6.79倍和10倍,見表1。

表1 不同分化程度鼻咽癌細(xì)胞株TOPFLASH—Luc和FOPFLASH-Luc的表達(dá)

2.2 cyclinD1的表達(dá) 角化性鱗癌中,cyclinD1的表達(dá)絕大部分呈弱陽性；在分化性非角化癌中,cyclinD1除表現(xiàn)為弱陽性外,中等強(qiáng)度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)的標(biāo)本增多；而在未分化型非角化癌中,絕大部分標(biāo)本為中等強(qiáng)度和強(qiáng)陽性表達(dá)。在8例角化性鱗癌標(biāo)本中,僅1例標(biāo)本為中度陽性,其余均為弱陽性的表達(dá)。分化型非角化癌中,38.71%的標(biāo)本呈中等強(qiáng)度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)；在未分化型非角化癌中,出現(xiàn)2例弱陽性、8例中度陽性表達(dá)以及30例強(qiáng)陽性,即95%的樣本出現(xiàn)中等/強(qiáng)陽性的表達(dá)(見圖1)。

圖1 HE×400,cyclinD1(+)

采用卡方檢驗(yàn)的方法對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到如下結(jié)果。角化性鱗癌和未分化型非角化癌中,cyclinD1表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,χ2=24.615,P＜0.001；分化型非角化癌與未分化型非角化癌比較,cyclinD1表達(dá)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=23.93,P＜0.001。而角化性鱗癌和分化型非角化癌比較,χ2=0.963,P=0.326,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 cyclinD1在不同組織學(xué)類型鼻咽癌中的表達(dá)水平

2.3 c-myc的表達(dá) 角化性鱗癌共8例標(biāo)本,而在這8個(gè)標(biāo)本中,有4例沒有表達(dá)c-myc蛋白,有2例為弱陽性表達(dá),另外有1例中等強(qiáng)度陽性和1例強(qiáng)陽性表達(dá)。即50%的角化性鱗癌病例出現(xiàn)強(qiáng)弱不等的c-myc的陽性表達(dá)。在31例分化型非角化癌中,總共有16例出現(xiàn)c-myc蛋白的陽性表達(dá)。其中,有3例為中等強(qiáng)度陽性,其余13例均為弱陽性。即有51.6%(16/31)的分化型非角化癌標(biāo)本出現(xiàn)c-myc蛋白的陽性表達(dá)。40例未分化型非角化癌中有33例標(biāo)本出現(xiàn)核陽性,即在82.5%(33/40)的未分化型非角化癌中可以檢測(cè)到c-myc蛋白的表達(dá),其中12例為弱陽性,10例為中等強(qiáng)度陽性,以及11例強(qiáng)陽性表達(dá)(見圖2)。根據(jù)卡方檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)未分化型非角化癌和分化型非角化癌比較,c-myc的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,χ2=7.79,P＜0.01；而未分化型非角化癌與角化性鱗癌比較,χ2=2.359,P＞0.05。(表3)

表3 c-myc在不同組織學(xué)類型鼻咽癌中的表達(dá)水平

圖2 HE×400,c-myc(+)

3 討 論

Wnt/β-catenin通路不僅在胚胎發(fā)育過程中參與背腹軸的形成,而且與細(xì)胞極性建立、細(xì)胞命運(yùn)決定以及細(xì)胞分化等多個(gè)發(fā)育事件有關(guān)。已有國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)此通路在乳腺上皮的分化過程中起重要作用[4]。同時(shí)已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤中有Wnt/βcatenin通路的異常激活。如肝癌[5]、結(jié)腸癌[6-7]、胰腺癌[8]、食管癌[9]等。

Wnt/β-catenin通路激活后,胞漿內(nèi)未被磷酸化降解的β-catenin即去磷酸化的β-catenin進(jìn)入核內(nèi),與Tcf/Lef結(jié)合成復(fù)合體,啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。為明確胞漿內(nèi)累積的β-catenin是否進(jìn)入核內(nèi)與Tcf結(jié)合而發(fā)揮作用,本研究采用TOPFLASH和FOPFLASH對(duì)3種不同分化鼻咽癌細(xì)胞株中βcatenin/Tcf復(fù)合體的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示低分化鼻咽癌細(xì)胞株 CNE-2和HONE-1中,TOPFLASH-Iuc明顯比FOPFLASH-luc含量高,而在高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中此兩者的含量卻沒有太大差異,說明鼻咽癌處于低分化時(shí)細(xì)胞核內(nèi)復(fù)合體含量有增多,且發(fā)現(xiàn)β-catenin/Tcf復(fù)合體在低分化鼻咽癌細(xì)胞株中的含量是高分化細(xì)胞株的80.0～123.6倍；上述結(jié)果提示了在低分化鼻咽癌細(xì)胞中,Wnt/β-catenin通路可能被異?；罨?導(dǎo)致β-catenin/Tcf復(fù)合體含量增高,再通過一系列機(jī)制抑制鼻咽癌細(xì)胞的分化。

cyclinD1是Wnt/β-catenin通路下游的主要靶基因,在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中都發(fā)現(xiàn)cyclinD1存在過度表達(dá),并與大腸癌組織的分化有關(guān)[10]。cyclinD1在鼻咽癌細(xì)胞中有過表達(dá)并呈細(xì)胞周期依賴性,其高表達(dá)可能為鼻咽癌發(fā)生過程中的重要事件[11]。作者發(fā)現(xiàn),在角化性鱗癌中,8例標(biāo)本中只有1例表現(xiàn)為中等陽性；在分化型非角化癌中,出現(xiàn)中等陽性和強(qiáng)陽性的樣本占38.71%；而在未分化型非角化癌中,卻有95%的標(biāo)本有中等陽性和強(qiáng)陽性的表達(dá)。根據(jù)這些數(shù)據(jù),不難看出,隨著鼻咽癌的分化程度的減低,cyclinD1在核內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng),這意味著,在鼻咽癌的分化過程中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能被某種原因激活,導(dǎo)致下游基因cyclinD1的表達(dá)增多,使細(xì)胞G1期縮短,細(xì)胞不停地進(jìn)入DNA合成期,最終導(dǎo)致細(xì)胞不斷增殖,抑制分化。

c-myc基因是被Wnt信號(hào)開啟的高度保守的癌基因,有研究認(rèn)為,c-myc的過表達(dá)與鼻咽癌的癌變過程有關(guān)[12]。檢測(cè)c-myc在鼻咽癌中的表達(dá),在分化型非角化癌中,有51.6%(16/31)的標(biāo)本出現(xiàn)c-myc的核陽性；而在未分化型非角化癌中,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)c-myc表達(dá)的標(biāo)本占82.5%(33/40)。表明在隨著鼻咽癌的分化程度的降低,c-myc在核內(nèi)的表達(dá)也越來越高。也就是說,作為Wnt/βcatenin通路下游的靶基因,c-myc在低分化的鼻咽癌中表達(dá)高,很可能是因?yàn)楦弑磉_(dá)的c-myc使細(xì)胞快速進(jìn)入S期,從而抑制分化,促進(jìn)細(xì)胞增殖。

CyclinD1在角化性鱗癌和分化型非角化癌中的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而在角化性鱗癌中,有50%的病例出現(xiàn)了c-myc的陽性表達(dá),與其在分化型非角化癌和未分化型非角化癌中表達(dá)的差異相比,雖然陽性率相對(duì)較低,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是因?yàn)榻腔憎[癌的樣本量較少(8例),與其他兩種組織學(xué)類型的差別太大而出現(xiàn)的誤差,因此有必要在將來的研究中增大角化性鱗癌的樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究的結(jié)果表明,隨著β-catenin/Tcf復(fù)合體表達(dá)水平的增高,cyclinD1和c-myc的表達(dá)都呈上調(diào)趨勢(shì)。本研究通過以上的結(jié)果,提示W(wǎng)nt/βcatenin通路在鼻咽癌分化過程中可能由于內(nèi)外環(huán)境改變被異常激活,使β-catenin在胞漿內(nèi)累積,并進(jìn)入核內(nèi)與Tcf結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)β-catenin/Tcf復(fù)合體含量增高,促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,抑制了鼻咽癌的分化。該發(fā)現(xiàn)可能為研究鼻咽癌失分化機(jī)制提供了新線索,也可能為鼻咽癌的誘導(dǎo)分化治療提供了新途徑。

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