超聲波萃取法提取恰瑪古中類黃酮的工藝研究

馬 菁，幸讓新，王華強，程衛(wèi)東

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子832003；2.天康生物添加劑分公司，新疆830013；3.神內(nèi)食品有限公司，石河子832003）

恰瑪古或恰麻古，學(xué)名蕪菁，又叫蔓菁、圓根、盤菜等，二年生草本植物，是新疆維吾爾族人民眾所周知的植物藥材之一。據(jù)檢測數(shù)據(jù)表明，恰瑪古中含亞油酸、類黃酮、皂苷等多種營養(yǎng)成分和維生素B1、B2、C、PP及鈣、鐵等有效元素，還富含大量氨基酸。

類黃酮化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一,具有吸收紫外線、抗癌、抗氧化、增加免疫力等多種功效,應(yīng)用前景廣泛,已成為近年來研究的熱點。許多類黃酮物質(zhì)已在食品工業(yè)、醫(yī)療保健、化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[1，2]。食品工業(yè)中,類黃酮化合物不僅可作甜味劑、風(fēng)味劑、增色劑、抗氧化劑,還是一類具有開發(fā)潛力的功能性食品[3，4]。由于超聲波產(chǎn)生的強烈振動、較快的加速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等,可使植物材料中的有效成分迅速進(jìn)入溶劑,從而增加有效成分的提取率,縮短超聲時間,并且還可避免高溫對提取成分的影響。因此，筆者對用超聲波萃取[5，6]恰瑪古中類黃酮物質(zhì)的工藝進(jìn)行了研究，以確定提取溶劑的濃度、液料比、超聲波功率、時間等的最佳參數(shù)，為恰瑪古資源的充分開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

恰瑪古由新疆南疆阿克蘇市提供，80℃恒溫干燥后粉碎過60目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供；無水乙醇由洛陽市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；NaOH由北京化工廠生產(chǎn)；硝酸鋁由天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；亞硝酸鈉由上海試劑一廠生產(chǎn)。以上試劑均為分析純。

UV-1240型分光光度計，由島津（日本）儀器有限公司提供；攪拌超聲波萃取儀，由上海新拓超聲波溶樣測試技術(shù)有限公司提供；電子天平由北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 影響提取工藝效果的因素試驗 （1）單因素試驗 稱取1g恰瑪古粉末,置于50 mL圓底燒瓶中,在不同條件下提取,以確定提取因素變化范圍以及各因素的較佳值。每次提取液過濾,用相應(yīng)濃度的乙醇定容并測定提取液中類黃酮的含量。（2）響應(yīng)面分析試驗 以乙醇濃度、液料比、超聲波功率和超聲時間等因素作為考察研究對象，采用中心組合試驗,以獲取最佳工藝參數(shù)。

1.2.2 恰瑪古類黃酮含量的測定[10，11]（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取經(jīng)120℃恒溫干燥至恒重，并于干燥器內(nèi)冷卻至室溫的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg置于200 mL容量瓶中，加少量30%乙醇水溶液，水浴微熱使其溶解，冷卻至室溫，再用30%乙醇定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.1 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，每個容量瓶中分別相當(dāng)含有蘆丁 0.0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg，然后分別加入30%乙醇水溶液至5 mL，搖勻后，各加5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加10%硝酸鋁水溶液0.3 mL，搖勻后，靜置6 min。最后加入4%Na0H溶液4.0 mL，搖勻，并用30%乙醇水溶液定容至刻度。放置15 min后，以第一管試劑溶液作空白對照，用722分光光度計在λ 500 nm處測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，如圖1所示。根據(jù)測定結(jié)果計算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：C=1.265 2A+0.004 8（R2=0.999 8）。（2）樣品的測定精確稱取恰瑪古粉末1 g于50 mL容量瓶中,在不同條件下進(jìn)行超聲波輔助提取,提取液經(jīng)離心過濾后,用相同濃度的乙醇溶液定容至50 mL。準(zhǔn)確吸取1 mL恰瑪古提取液于10 mL容量瓶中,按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,置于比色皿中,在波長500 nm處測定吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出樣品溶液質(zhì)量濃度C,再計算出樣品中類黃酮含量,計算公式為:

其中:C為樣液中類黃酮的濃度(單位：mg/mL)；V為樣液的稀釋體積（單位：mL）；M為樣品質(zhì)量（單位：g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗

2.1.1 響應(yīng)面分析法單因素試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為提高試驗結(jié)果的可靠性，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，采用四因素三水平的旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，以類黃酮含量為響應(yīng)值，確定超聲波萃取類黃酮的最佳工藝參數(shù)，如表1所示。

根據(jù)相應(yīng)的設(shè)計試驗方案進(jìn)行試驗后，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合,得到適宜的回歸方程,對此方程所代表的面進(jìn)行分析，推測最佳條件在試驗中所覆蓋的區(qū)域，或判斷試驗的最佳途徑。試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析軟件采用Design Expert 7.1.3。

2.2.2 響應(yīng)面分析法正交試驗 按照中心組合設(shè)計試驗方案進(jìn)行四因素三水平試驗，試驗結(jié)果參見表2。

將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以類黃酮含量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

回歸方程的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可知,模型(p值為0.000 1)是非常顯著的，模型失擬項(Lack of fit)表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率。而失擬項p值為0.1069，大于0.05，模型失擬項不顯著,模型選擇合適?；貧w系數(shù)R2=0.971 7，大于0.9，說明模型相關(guān)度很好。因此，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

通過Design Expert 7.1.3軟件繪制可視化響應(yīng)面分析曲線圖，調(diào)查相關(guān)變量間的交互作用以及確定最優(yōu)點，圖1～6是以類黃酮含量為響應(yīng)值的趨勢圖，其等高線圖可直觀反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。

圖1 乙醇濃度與液料比交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

圖2 乙醇濃度與超聲波功率交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

圖3 乙醇濃度與超聲時間交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

圖4 液料比與超聲波功率交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

圖5 液料比與超聲時間交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

圖6 超聲波功率與超聲時間交互影響類黃酮含量的曲面圖和等高線圖

由等高線圖和方差分析結(jié)果得出，圖2、5等高線呈圓形，交互作用不顯著；圖1、3、4、6中等高線均呈橢圓形,表明兩因素交互作用均顯著。由圖1～6響應(yīng)面立體圖可知,響應(yīng)值存在最大值,經(jīng)軟件分析計算,得到類黃酮含量預(yù)測值最大時的工藝條件：乙醇濃度為51.73%，液料比41.50∶1，超聲波功率438.00 W，萃取時間55.54 min，預(yù)測值為0.536 5 g/100 g。在優(yōu)化條件下，考慮到實際操作的方便，將超聲波萃取恰瑪古中類黃酮最佳工藝修正為乙醇濃度52%，液料比41∶1，超聲波功率438 W，萃取時間55 min。對試驗結(jié)果進(jìn)行5次驗證試驗，結(jié)果表明，類黃酮的提取含量為0.509 6 g/100 g，與理論預(yù)測值基本吻合。

3 結(jié) 論

通過采用中心組合設(shè)計試驗和響應(yīng)面試驗分析，得到乙醇濃度、液料比、超聲波功率和超聲時間4因素對恰瑪古中類黃酮提取含量的影響結(jié)果。恰瑪古中類黃酮超聲波提取工藝參數(shù)的回歸方程為:Y=0.500+0.026X1+0.042 X2+0.032 X3+0.046 X4+0.042 X1X2+0.001X1X3+0.032 X1X4+0.024 X2X3+0.011 X2X4+0.023 X3X4－0.075－0.082－0.069－0.058。方差分析結(jié)果表明，擬合檢驗極顯著,決定系數(shù)達(dá)0.971 7，該方程能較好地預(yù)測恰瑪古中類黃酮提取含量隨各參數(shù)變化的規(guī)律。超聲波萃取法提取恰瑪古類黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度52%，液料比41∶1，超聲波功率438 W，超聲時間55 min，類黃酮提取含量為0.509 6 g/100 g。

[1]肖坤福,廖曉峰.類黃酮類化合物研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2003，25(4):14－18.

[2]汪秋安.天然黃酮類化合物的生理功能及其應(yīng)用[J].香料香精化妝品,1999，19(1):28－33.

[3]郭長江.食物類黃酮物質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)意義[J].中國食物與營養(yǎng),2004，21(3):38－40.

[4]鄧建仙.功能性食品[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1995:211.

[5]萬素英,趙亞軍,李 琳,等.食品抗氧化劑[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998:152－167.

[6]謝明杰,宋 明,鄒翠霞,等.超聲波萃取大豆異黃酮[J].大豆科學(xué),2004,23(1):74－76.

[7]朱宏莉,韋海洪,宋紀(jì)蓉，等.竹葉類黃酮的提取和純化工藝的研究[J].食品科學(xué)，2005，26(8)：158－161.

[8]劉峙嶸,俞自由,方裕勛,等.超聲波萃取銀杏葉黃酮類化合物[J].東華理工學(xué)院學(xué)報，2005，28(2)：151－154.