納米微粒對(duì)乙二醇溶液過(guò)冷度的影響

高志新 郝保同 劉寶林 王 欣 周國(guó)艷

1 引言

與平衡凍結(jié)過(guò)程相比，過(guò)冷度大的溶液往往形成尖細(xì)的樹枝狀晶體，細(xì)胞和細(xì)胞間隙組織更容易受到這種針尖狀晶體的機(jī)械損傷［1］。因此，通過(guò)提高低溫保護(hù)劑溶液的成核溫度，有效的降低溶液的過(guò)冷度，對(duì)細(xì)胞和組織的成功保存是非常重要的。

羥基磷灰石納米微粒由于具有極強(qiáng)的親水性表面和較小的體積，易在水溶液中懸浮，而且對(duì)細(xì)胞和生物組織沒有毒性，可誘發(fā)保護(hù)劑凍結(jié)過(guò)程的異相成核，提高過(guò)冷度。已有文獻(xiàn)證明了納米微粒在常溫狀態(tài)下可以增強(qiáng)流體的導(dǎo)熱系數(shù)［2］、傳熱效率［3］以及臨界熱流量［4］等。正是由于納米微粒在常溫狀態(tài)下表現(xiàn)的優(yōu)良特性，有些學(xué)者嘗試將納米微粒引入低溫生物學(xué)領(lǐng)域。Han［5］等將納米微粒加入到低溫保護(hù)劑中，發(fā)現(xiàn)納米微粒能提高溶液相變點(diǎn)以上的導(dǎo)熱系數(shù)和降低溶液的反玻璃化溫度，并從納米微粒顯著促進(jìn)冰晶的成核過(guò)程做了初步解釋。但是納米微粒在相變點(diǎn)溫度以下，能顯著的增加溶液的粘度，影響低溫保護(hù)劑的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了納米低溫保護(hù)劑的在降溫過(guò)程中的凍結(jié)特性，關(guān)于這方面的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用DSC研究了HA納米微粒對(duì)乙二醇溶液降溫過(guò)程的凍結(jié)參數(shù)，為進(jìn)一步完善低溫保護(hù)劑的配置和細(xì)胞的成功保存提供了理論與方法支持。

2 材料與方法

2.1 材料

乙二醇(威爾昆化學(xué)試劑有限公司)為實(shí)驗(yàn)用分析純?cè)噭?，純度?9.8%。羥基磷灰石(HA)納米微粒純度為99.99%，形狀為半球形或者球形(南京埃普瑞納米材料有限公司)。溶液配制和儀器標(biāo)定均采用二次蒸餾水。標(biāo)定用的環(huán)戊烷(上海生化試劑公司)為色譜標(biāo)準(zhǔn)試劑，標(biāo)定用水和溶液配制用水均為本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的二次蒸餾水。乙二醇在使用前用CaH2處理并經(jīng)減壓蒸餾。二次蒸餾水使用前用0.2 um微孔濾紙過(guò)濾。

2.2 差示掃描量熱儀(DSC)

本實(shí)驗(yàn)用差示掃描量熱儀為DSC-Pyris Diamond(美國(guó)Perkin-Elmer公司)。溫度標(biāo)定采用環(huán)戊烷的晶-晶轉(zhuǎn)變點(diǎn)(外推起始溫度為-135.06℃)和二次蒸餾水的熔融溫度0℃(均采用外推起始溫度)進(jìn)行兩點(diǎn)標(biāo)定［6］。液氮冷卻采用CryofillTM，Perkin-Elmer公司的液氮容器控制。樣品沖洗氣體為高純度氦氣(純度 ＞ 99.999%)，流量30 mL/min保持不變。樣品皿為標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿(美國(guó)Perkin-Elmer公司)，樣品量為 5 mg—15 mg，精確到 ±0.01 mg。天平采用賽多利斯的BP211D，精確到0.01 mg。

2.3 試驗(yàn)方法

溶液均以質(zhì)量濃度配置。乙二醇溶液的濃度分別為 0，1%，5%，15%20%，30%，40%。羥基磷灰石納米微粒的質(zhì)量濃度分別為0.05%，0.1%，和0.2%，粒徑分別為20 nm，40 nm，60 nm。納米微粒加入乙二醇溶液后采用細(xì)胞超聲震蕩粉碎儀震蕩，定時(shí)90分鐘，超聲功率為350 kW。樣品皿采用標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿，并用液固通用壓機(jī)(美國(guó))壓制密封。每一個(gè)樣品都必須按照相同升降溫程序?qū)悠访蟆?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)皿和空皿進(jìn)行掃描，然后再進(jìn)行下一個(gè)樣品。為消除試樣的熱歷史，加樣后首先將試樣以150℃/min快速升溫到所需溫度區(qū)間的上限，然后以150℃/min快速降溫到所需溫度區(qū)間的下限。如此重復(fù)2—3次，調(diào)至實(shí)驗(yàn)起始溫度，恒溫3 min—5 min，然后以相同的降溫和升溫速率掃描并記錄熱流數(shù)據(jù)，掃描速率為10℃/min。待熱流穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品作3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。

2.4 數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)變溫度采用熱分析軟件Pyris Software(美國(guó)Perkin-Elmer公司，5.0版本)讀取。在相變前后比熱變化不大時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)基線，變化較大時(shí)使用“S”形基線。成核溫度取臺(tái)階上升沿斜率最大點(diǎn)和基線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度即外推起始溫度。熔融溫度取熔融峰頂點(diǎn)溫度(peak)［7］。如圖1所示為40%乙二醇溶液降溫和復(fù)溫DSC熱流曲線。為方便起見，在取實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，將每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的6組數(shù)據(jù)舍棄最大值和最小值，取4個(gè)數(shù)據(jù)的平均值作為分析的依據(jù)。

圖1 0.1%HA納米微粒+15%EG溶液降溫曲線Fig.1 DSC cooling thermograms of 0.1%HA nanoparticles and 15%EG solution

3 結(jié)果與討論

基于冰晶的成核理論［1］，在結(jié)晶過(guò)程中，母相中產(chǎn)生穩(wěn)定的新相核的過(guò)程稱為成核過(guò)程。根據(jù)成核機(jī)理的不同分為均相成核和異相成核。均相成核過(guò)程是由于液相內(nèi)的能量和密度的隨機(jī)起伏漲落，系統(tǒng)內(nèi)的分子不時(shí)的聚集成團(tuán)而自發(fā)的成核過(guò)程。與均相成核相比異相成核更常見，異相成核是由于溶液中參雜了外來(lái)的雜質(zhì)顆?；蛘呓佑|已有的界面如容器壁面等，這些不純物質(zhì)和界面起到了晶種的作用。這樣的成核過(guò)程為異相成核。因此本實(shí)驗(yàn)所說(shuō)的成核溫度指的是異相成核溫度。

不同濃度的溶液其平衡凍結(jié)點(diǎn)是不同的，降溫時(shí)，溶液只有先過(guò)冷到其平衡凍結(jié)點(diǎn)以下的某個(gè)溫度，溶液中的水才開始凍結(jié)。溶液的平衡凍結(jié)點(diǎn)與成核溫度之差稱為溶液凍結(jié)的過(guò)冷度［8］。

3.1 HA納米微粒對(duì)不同濃度乙二醇溶液成核溫度的影響

由圖2可知加入HA納米微粒的乙二醇溶液與純乙二醇溶液相比較，在一定的濃度范圍內(nèi)，降溫或升溫過(guò)程所表現(xiàn)的相行為有許多相似之處。在降溫過(guò)程中，溶液均要先過(guò)冷到某一溫度才開始凍結(jié)，且凍結(jié)溫度隨著溶液濃度的增加而降低，原因是乙二醇分子與水分子之間有較強(qiáng)的氫鍵作用，這些氫鍵的存在降低了形成冰晶所需要的相變驅(qū)動(dòng)力［9］。同結(jié)晶過(guò)程相比較，熔融過(guò)程在較寬的范圍內(nèi)完成的。在質(zhì)量濃度低于20%時(shí)，加入納米微粒后溶液成核溫度變化不明顯，但是當(dāng)溶液濃度高于20%時(shí)，加入納米微粒能顯著的提高溶液的成核溫度。可能的原因是，當(dāng)溶液的濃度與納米微粒的加入量均較小時(shí)，此時(shí)溶液中水分子占據(jù)主導(dǎo)作用，因此溶液的成核特性更多的表現(xiàn)為純水的凍結(jié)特性。納米微粒，乙二醇分子及水分子之間的相互作用還不足以對(duì)溶液的凍結(jié)過(guò)程產(chǎn)生較大的影響。溶液凍結(jié)的隨機(jī)性比較大。但是隨著溶液濃度的增加，溶質(zhì)-溶劑之間的相互作用開始對(duì)溶解過(guò)程產(chǎn)生明顯的影響，主要表現(xiàn)在大大降低了溶液凍結(jié)的隨機(jī)性。

圖2 不同濃度的乙二醇溶液成核溫度Fig.2 Nucleation temperature of different concentrations of EG solution

3.2 不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的HA納米微粒對(duì)EG溶液過(guò)冷度的影響

由表1可知對(duì)40%的乙二醇溶液加入不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的HA納米微粒，溶液的成核溫度與過(guò)冷度均顯著的降低。加入HA納米微粒的粒徑越大或者質(zhì)量濃度越大，溶液過(guò)冷度降低的越顯著。

表1 用DSC測(cè)得加入HA納米微粒的乙二醇溶液的成核溫度和熔融溫度Table 1 Nucleation temperature and melting temperature of different concentrations of EG solution measured by DSC

將HA納米微粒加入乙二醇溶液中，HA納米微粒便起到了成核基體的作用，在異相成核過(guò)程中成核界面是已經(jīng)存在的，晶體的生長(zhǎng)是由低能量的晶核和成核基體取代原先的界面，這種界面取代比界面產(chǎn)生所需能量小。即其成核勢(shì)壘小，所以異相成核將在比較小的過(guò)冷度下發(fā)生。在低濃度區(qū)間溶液的凍結(jié)隨機(jī)性較大，但是在中高濃度區(qū)間，由于溶液內(nèi)各組分之間的相互作用，有效的抑制了這種隨機(jī)性，溶液的凍結(jié)表現(xiàn)出較強(qiáng)的規(guī)律性。但是溶液的微觀結(jié)構(gòu)與溶液的宏觀性質(zhì)-過(guò)冷度到底存在一個(gè)什么樣的定量關(guān)系，單純的依靠DSC是很難做出解釋的。依靠異相成核的機(jī)理，定性的分析了HA納米微粒加入乙二醇溶液后的成核現(xiàn)象以及對(duì)溶液過(guò)冷度的影響。

圖3所示為異相成核示意圖。將HA納米微?？闯砂霃綖镽n的成核基體，晶胚為半徑是r的球冠，θ為其接觸角。異相成核時(shí)的臨界晶核半徑r*和臨界成核勢(shì)壘ΔG*

其中:

式中:σ12是納米粒子與流體之間的比表面自由能;σ23是晶核與納米粒子之間的比表面自由能;σ12是晶核與流體之間的比表面自由能。

圖3 異相成核示意圖

圖4給出了f(η，x)隨x的變化情況，由圖可見隨x增大，f(η，x)是減小的，這時(shí)ΔG*也減小，這表明當(dāng)Rn增大時(shí)溶液容易成核，與實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果相同。同時(shí)由于-1≤η≤1，對(duì)相同的x，η越大成核勢(shì)壘越小，較大的η也反映了濕潤(rùn)程度大，這時(shí)雜質(zhì)基體與晶體之間的界面能σ23較小，故而利于成核。HA納米微粒具有較大的面積與體積比，和極強(qiáng)的親水性，即晶胚與納米微粒的濕潤(rùn)程度較大，更加有利于冰晶的成核。

4 結(jié)論

利用差熱掃描熱儀(DSC)研究了HA納米微粒對(duì)乙二醇溶液的成核溫度和過(guò)冷度的影響。證明納米微粒能顯著的促進(jìn)晶核的形成和降低溶液的過(guò)冷度。并通過(guò)異相成核簡(jiǎn)要分析了納米微粒對(duì)保護(hù)劑溶液的作用機(jī)理。深入的分析納米低溫保護(hù)劑在降溫、復(fù)溫過(guò)程中產(chǎn)生的一系列熱力學(xué)變化以及納米微粒與溶液分子間的相互作用，為改進(jìn)生物材料的低溫保存和研究納米微粒在低溫領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

圖4 f(η，x)隨x的變化Fig.4 Relationship between f(η，x)with changes of x

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