噻唑橙-殼聚糖-葉酸靶向熒光探針的制備及性能研究

孟慶洋，費(fèi)學(xué)寧，王義啟

(天津城市建設(shè)學(xué)院 材料科學(xué)與工程系，天津 300384)

熒光染料是一種廣泛使用的熒光標(biāo)示劑(又稱為熒光探針)，具有檢測(cè)速度快、重復(fù)性好、用樣量少、無輻射等優(yōu)點(diǎn)．單體噻唑橙(TO)噁和 唑黃(YO)系列及其二聚體染料為典型的嵌入式探針，該種熒光探針染料對(duì)腫瘤細(xì)胞比對(duì)正常細(xì)胞更具親和力，由于其標(biāo)記速度快、接近生理 pH條件、對(duì)生物分子的功能活性影響小，因此已成為研究比較活躍的一類典型標(biāo)記菁染料[1]．

近二十多年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展、免疫物質(zhì)的化學(xué)研究與發(fā)展，以及對(duì)新藥物資源的尋找與開發(fā)，對(duì)多糖的研究受到越來越廣泛的重視[2-4]．殼聚糖[5-6](Chitosan，簡稱 CTS)是一種來源豐富、具有良好生物相容性及生物可降解性的天然高分子材料．由于殼聚糖分子內(nèi)的羥基、氨基活潑性較強(qiáng)，因而容易對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改性；還可根據(jù)特定的對(duì)象選擇合適的生物分子進(jìn)行修飾，如修飾配體定位受體及修飾探針DNA、檢測(cè)目標(biāo) DNA 等，為生物醫(yī)學(xué)研究提供一種傳統(tǒng)熒光檢測(cè)的新方法[7]．因殼聚糖的存在，在配體與染料之間起到了一種橋梁的作用，并可增加染料的細(xì)胞相容性，降低毒性．同時(shí)，一個(gè)殼聚糖上接枝多個(gè)染料分子，在與組織結(jié)合和成像時(shí)所表現(xiàn)出的光學(xué)加合效應(yīng)，對(duì)提高探針分子的靈敏度，降低使用量方面有積極意義．2005年，朝鮮Wonkwang大學(xué)的Kim等人[8]以半乳糖修飾的殼聚寡糖異硫氰熒光染料對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行靶向成像，光學(xué)成像主要位于肝細(xì)胞．

葉酸作為靶向配體用于腫瘤靶向識(shí)別是近年備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一．葉酸是一種人體必需的 B組維生素，它在體內(nèi)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是通過葉酸受體，特別是在多種上皮腫瘤組織，葉酸受體的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織[9]，這是腫瘤組織快速增殖所必需的．已有研究顯示，將殼聚糖與葉酸偶聯(lián)，可作為 DNA 或RNA 的靶向載體[10-11]．

本文研究的目的是用殼聚糖修飾噻唑橙類衍生物，從而改善噻唑橙熒光染料的水溶性；同時(shí)通過偶聯(lián)葉酸，特異識(shí)別葉酸受體過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞靶向識(shí)別的作用．其合成路線如圖1所示．

圖1 TO-COOH-CTS-Folate反應(yīng)示意圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料和儀器

所用試劑均為市售分析純，薄層色譜所用硅膠(GF254型)為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品，熒光分光光度計(jì)為Cary Eclipase(美國瓦里安公司)生產(chǎn)，紅外光譜儀 Nicolet380(美國熱電集團(tuán))，差熱分析儀為EXSTAR6000 TG/DTA差熱質(zhì)量分析儀(日本SEIKO公司)．

1.2 TO-COOH-CTS的制備

分別將 100 mg(0.19 mmol)TO-COOH、78 mg(0.38 mmol)N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、44 mg(0.38 mmol) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和57 mg(0.57 mmol)的三乙胺加入 20 mL無水 DMSO中，室溫?cái)嚢柚脸示囿w系，然后加入30 mL甲醇，攪拌均勻，冷卻至-5 ℃；向其中加入10 mL含有1 g CTS(相對(duì)分子質(zhì)量＜3 000)的 1%醋酸水溶液．在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60 ℃加熱攪拌反應(yīng)．反應(yīng)停止后，加入乙醚萃取，下層溶液用 100 mL丙酮沉淀，過濾，甲醇洗滌沉淀物，干燥，得到 500 mg的紅色固體．其他條件的實(shí)驗(yàn)操作如上所述．

1.3 TO-COOH-CTS制備工藝的優(yōu)化

1.3.1 TO和TO-CTS的紫外吸收及CTS修飾后TO相對(duì)量的確定

為確定CTS修飾后的TO的濃度與吸光度的定量關(guān)系，首先要確定TO與TO-CTS的相關(guān)性．采用紫外掃描光譜確定其相互關(guān)系，結(jié)果如圖2所示．

由圖2可知：TO與TO-CTS具有相同的紫外吸收特征，波形一致，說明CTS對(duì) TO的紫外吸收沒有產(chǎn)生影響，因此可通過 TO的紫外吸收強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系來確定CTS修飾后的染料中所含TO的相對(duì)量．

圖2 熒光染料紫外吸收光譜

1.3.2 TO-COOH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取 TO-COOH 5 mg，置于 100 mL容量瓶中，用二甲基亞砜(DMSO)溶解并稀釋到刻度；分別取10.0，6.0，5.0，4.0，3.0，2.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用 DMSO稀釋到刻度，以 DMSO溶液為空白，用紫外分光光度計(jì)在 507 nm 處測(cè)定吸光度．以 TOCOOH濃度對(duì)吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.3.3 偶聯(lián)比的計(jì)算

取制得的TO-COOH-CTS 5 mg溶于水中，用水定溶至10 mL，然后在507 nm處測(cè)定紫外吸光度，計(jì)算每毫克CTS上偶聯(lián)的TO-COOH毫克數(shù)．偶聯(lián)比(GR)的計(jì)算公式為

式中：m為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出的 5 mg復(fù)合物中含有的TO-COOH的質(zhì)量．

1.4 TO-COOH-CTS-Folate的合成

將葉酸 1.5 g(1.7 mmol)、DCC 1.4 g(3.4 mmol)、NHS 780 mg(3.4 mmol)和1 mL的三乙胺溶于70 mL無水DMSO中，避光過夜攪拌，直至葉酸溶解，過濾除去副產(chǎn)物；向其中加入40 mL含有360 mgTO-COOHCTS的水溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)，50 ℃加熱攪拌 24 h；停止反應(yīng)，過濾，濾餅用pH＝7.4的緩沖溶液洗滌，丙酮洗滌，干燥，得到400 mg紅色固體．

2 結(jié)果與討論

2.1 TO-COOH-CTS的結(jié)構(gòu)表征

通過紅外光譜(IR)和差熱分析(DTA)，對(duì)制得的TO-COOH-CTS和 TO-COOH-CTS-Folate的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征．

2.1.1 TO-COOH-CTS的紅外光譜

采用紅外光譜對(duì)TO-COOH-CTS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示．

圖3 CTS、TO-CTS、TO的紅外光譜

由圖3可知：在 3 448 cm-1左右為殼聚寡糖中O—H基的伸縮振動(dòng)峰和N—H基的伸縮振動(dòng)峰重疊而成的多重吸收峰；在 1 643 cm-1左右為殼聚糖上氨基的特征吸收峰；在 1 519，1 470，1 547 cm-1左右為TO內(nèi)的芳環(huán)骨架振動(dòng)峰；在CTS和TO-COOH物理混合物(CTS＋TO-COOH)的紅外譜圖中也有以上特征峰；但 TO-COOH-CTS的紅外光譜曲線中吸收峰1 504，1 464，1 550 cm-1為芳環(huán)骨架振動(dòng)；在 754 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，是六元環(huán)內(nèi)氫鍵的骨架振動(dòng)峰．

2.1.2 TO-COOH-CTS的差熱分析譜圖

采用差熱分析對(duì)TO-COOH-CTS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4所示．

圖4 CTS、TO-CTS、TO的差熱分析曲線

由圖4可知：①CTS的熱分解可分為二個(gè)階段，第一步分解在 30～80 ℃，主要是脫去所帶的部分水分；第二步是在200～400 ℃，在220 ℃左右出現(xiàn)一個(gè)小的吸熱峰，當(dāng)溫度升至 280 ℃左右時(shí)出現(xiàn)大量放熱，峰形變寬而高．②在TO-COOH的DTA曲線中，在 30～80 ℃范圍內(nèi)時(shí)，TO-COOH 脫水的吸熱峰很小，在160 ℃左右和185 ℃又出現(xiàn)兩個(gè)小的特征吸熱峰．③接枝后的產(chǎn)物的DTA曲線明顯不同于CTS和TO-COOH 的，其在 276 ℃左右時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的放熱峰，CTS放熱峰在 283 ℃；而且在 185 ℃時(shí) TOCOOH的特征吸熱峰消失；同時(shí)，TO-COOH-CTS在229 ℃時(shí)出現(xiàn)了新的吸熱峰．

結(jié)合圖3和圖4可知，CTS和TO-COOH不是簡單的物理混合，殼聚糖已與羧基噻唑橙反應(yīng)形成了復(fù)合物．

2.2 反應(yīng)條件對(duì)偶聯(lián)比的影響

根據(jù) TO-COOH-CTS的制備條件，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)底物用量等對(duì)偶聯(lián)比有影響的因素分別進(jìn)行研究．

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)比的影響

保持原料投量和反應(yīng)溫度不變，改變反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定偶聯(lián)比隨反應(yīng)時(shí)間變化的曲線，結(jié)果如圖5所示．

圖5 偶聯(lián)比隨時(shí)間的變化曲線

由圖5可知：開始時(shí)，反應(yīng)物濃度較大，反應(yīng)進(jìn)行的較快，所以偶聯(lián)比隨反應(yīng)時(shí)間的延長先增加，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到 5 h時(shí)，偶聯(lián)比達(dá)到最大；繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，隨著接枝鏈TO-COOH-CTS的不斷增長，體系黏度變大，單體難以擴(kuò)散到接枝活性中心，致使偶聯(lián)比開始減小；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá) 12 h后，反應(yīng)速率減緩，偶聯(lián)比趨于平穩(wěn)．

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)偶聯(lián)比的影響

保持原料投量和反應(yīng)時(shí)間不變，改變反應(yīng)溫度，測(cè)定偶聯(lián)比隨反應(yīng)溫度的變化曲線，結(jié)果如圖6所示．

圖6 偶聯(lián)比隨反應(yīng)溫度的變化曲線

由圖6可知：此反應(yīng)在室溫條件下就可以進(jìn)行，偶聯(lián)比隨溫度升高先增大，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到 95 ℃左右時(shí)，偶聯(lián)比達(dá)到最大，隨后趨于減小．這是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)，單體運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，使 TO-COOH單體易于擴(kuò)散至 CTS附近，有利于接枝；而溫度過高時(shí)，反應(yīng)體系不穩(wěn)定，不利于反應(yīng)進(jìn)行．

2.2.3 CTS與TO-COOH的比例對(duì)偶聯(lián)比的影響

保持反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度不變，改變投料比例，測(cè)定偶聯(lián)比隨CTS與TO-COOH的比例變化曲線，結(jié)果如圖7所示．

圖7 偶聯(lián)比隨CTS與TO-COOH比例的變化曲線

由圖7可知：偶聯(lián)比隨著CTS與TO-COOH比例的減少而增加，當(dāng) CTS與 TO-COOH的摩爾比值小于 10∶1以后，接枝率的增加趨于平緩(CTS的分子質(zhì)量按每個(gè)結(jié)構(gòu)單元的 161 g/mol計(jì)算)．因?yàn)殡S著 TO-COOH比例的增加，TO-COOH的濃度相應(yīng)增加，其擴(kuò)散速度加快，偶聯(lián)比增加；而隨著反應(yīng)進(jìn)行程度的不斷加深，體系黏度會(huì)增大，TO-COOH向接枝鏈的擴(kuò)散受阻，從而使接枝鏈增加緩慢；當(dāng) TOCOOH的量增至一定值后，偶聯(lián)比趨于一穩(wěn)定值．綜合考慮，以CTS與TO-COOH的摩爾比值等于10∶1為最佳．

2.3 TO-COOH-CTS的熒光分析

采用熒光光譜法對(duì)所制備的染料衍生物進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如圖8所示．

圖8 TO-COOH和TO-COOH-CTS的熒光光譜

由圖8可知：相同 TO濃度的 TO-COOH-CTS與 TO-COOH相比，熒光最大發(fā)射波長無明顯變化，而熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，熒光量子效率也有明顯的提高．這是因?yàn)門O-COOH-CTS中CTS部分的空間阻礙作用在一定程度上限制了 TO分子的旋轉(zhuǎn)角度，改變了 TO分子的空間構(gòu)象，進(jìn)而使 TO-COOH-CTS的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化．關(guān)于TO-COOH與CTS及細(xì)胞的多重相互作用關(guān)系正在研究中．

2.4 TO-COOH-CTS-Folate的紅外光譜

采用紅外光譜法對(duì)TO-COOH-CTS-Folate的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖9所示．

圖9 TO-COOH-CTS、Folate、TO-COOH-CTS-Folate的紅外光譜

由圖9可知：在 TO-COOH-CTS的紅外光譜曲線中，1 504，1 464，1 550 cm-1處為芳環(huán)骨架振動(dòng)，1 643 cm-1為 CTS上—NH2的彎曲振動(dòng)吸收峰；葉酸的紅外譜圖中，3 415 cm-1左右為—OH和—NH2的伸縮振動(dòng)峰，1 693 cm-1為羧基中 C＝O 的特征峰；在TO-COOH-CTS和葉酸的物理混合物(Folate＋TOCOOH-CTS)的紅外譜圖中也有以上特征峰，但在葉酸偶聯(lián)TO-COOH-CTS的紅外譜圖中，在1 655 cm-1處新出現(xiàn)了一個(gè)酰胺鍵中 C＝O的特征峰；在3 420 cm-1左右的特征峰與葉酸相比有偏移現(xiàn)象，而且 TO-COOH-CTS-Folate中，葉酸羧基中 C＝O的特征峰也消失．以上區(qū)別說明了葉酸已與 TOCOOH-CTS反應(yīng)形成了復(fù)合物．

2.5 TO-COOH-CTS-Folate的差熱分析

采用差熱分析對(duì)TO-COOH-CTS-Folate的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖10所示．

由圖10可知：在葉酸的DTA曲線中，在130 ℃左右的小峰是脫水的吸熱峰，160 ℃左右為結(jié)晶水的吸熱峰，193 ℃左右出現(xiàn)一特征吸熱峰，當(dāng)溫度升至423 ℃時(shí)峰形變寬，為葉酸的特征吸熱峰，溫度升到442 ℃左右時(shí)出現(xiàn)放熱，峰形變高而尖；在TO-CTS的曲線中，220 ℃時(shí)出現(xiàn)一特征吸熱峰，在276 ℃左右時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的放熱峰，峰形高而寬；而接枝后的產(chǎn)物的曲線明顯不同于葉酸和TO-COOH-CTS，其在295℃左右出現(xiàn)放熱峰，且峰形變平緩，TO-CTS放熱峰在277 ℃，峰形高而寬，而且在193 ℃處葉酸的特征吸熱峰消失，在385 ℃左右出現(xiàn)寬而低的吸熱峰，葉酸的放熱峰在423 ℃左右．同時(shí)，TO-COOH-CTSFolate在465 ℃左右時(shí)出現(xiàn)了新的吸熱峰．以上區(qū)別說明了葉酸和TO-COOH-CTS不是簡單的物理混合，而是葉酸已與TO-COOH-CTS反應(yīng)形成了復(fù)合物．

2.6 細(xì)胞標(biāo)記的研究

用 TO-COOH、TO-COOH-CTS和 TO-COOHCTS-Folate對(duì)TJ905細(xì)胞標(biāo)記24 h后的照片如圖11所示．

由圖11可知：TO在細(xì)胞核中表現(xiàn)出較好的熒光性能，但細(xì)胞質(zhì)中沒有熒光；TO-CTS在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均表現(xiàn)出了較好的熒光性能，TO-CTS在細(xì)胞染色過程中沒有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，同時(shí)修飾后的染料可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，表現(xiàn)出比 TO更強(qiáng)的熒光現(xiàn)象；TO-COOH-CTS-Folate與 TO的標(biāo)記情況相似，同樣在細(xì)胞核中表現(xiàn)出較好的熒光性能，而細(xì)胞質(zhì)中沒有熒光．

3 結(jié) 論

TO-COOH作為噻唑橙的一種衍生物，具有獨(dú)特的熒光特性，將殼聚糖引入，對(duì) TO進(jìn)行修飾設(shè)計(jì)，合成了TO-COOH-CTS，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過IR、DTA確認(rèn)．熒光光譜研究表明，TO-COOH-CTS與 TO-COOH相比具有明顯的熒光增強(qiáng)效應(yīng)．將葉酸接枝到 TO-COOH-CTS 上，得到了 TO-COOH-CTS-Folate，細(xì)胞熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，TO及其衍生物可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光現(xiàn)象，并在細(xì)胞生理?xiàng)l件下穩(wěn)定存在．關(guān)于TO與CTS及細(xì)胞的多重作用關(guān)系，以及葉酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用的研究尚在進(jìn)行中．

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