粘膜佐劑LTB優(yōu)化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻飼免疫效果研究①

王 健 胡四海 戴志兵 胡耀華 張愉快 余敏君 (南華大學病原生物學研究所,衡陽421001)

淋病奈瑟菌俗稱淋球菌,是引起淋病的病原菌,淋病是我國目前發(fā)病人數(shù)最多的性傳播疾病,感染淋球菌還可增加HIV傳播的危險性[1]。如何有效控制和預防淋病,成為全世界普遍關注的公共衛(wèi)生問題,而研制出有效的疫苗,是預防和控制淋病的關鍵。Plante等[2]首先克隆了奈瑟氏淋球菌的表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,NspA)基因,發(fā)現(xiàn)NspA抗原不但能在淋球菌表面持續(xù)表達,而且高度保守、具有較強免疫原性,是一個頗具潛力的淋球菌疫苗候選抗原。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(Bsubunit of Escherichia coli heat-labile entero-toxin,LTB)是繼霍亂弧菌腸毒素CTB之后發(fā)現(xiàn)的一種有效的粘膜佐劑,它去除了大腸桿菌不耐熱腸毒素的毒性A亞單位,仍保留較好的粘膜佐劑活性[3]?？沽懿∶庖咧饕矿w液免疫,尤其是粘膜免疫。為了研究具有較強粘膜保護能力的淋球菌疫苗,本課題組將 nspA和ltB基因融合,構建了pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗。本研究在此基礎上將該融合基因疫苗通過鼻飼途徑免疫雌性BALB/c小鼠,檢測其所誘發(fā)的特異性體液免疫應答(尤其是粘膜免疫應答)和細胞免疫應答水平,為研制高效抗淋病基因疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體、抗原及實驗動物 E.coli JM109本室保存;pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA載體(本課題組已成功轉染真核細胞)由本室保存;重組蛋白NspA由南華大學病原生物學研究所本課題組提供;SPF級4～6周齡雌性BALB/c小鼠購自南華大學實驗動物學部。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京博大泰克生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、HindⅢ)購自大連寶生物工程公司。DNA ladder購自晶美生物工程公司;二抗:HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記羊抗鼠sIgA分別購自Abcam和Sigma公司;IFN-γ含量測定試劑盒購自晶美生物公司;其他試劑為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 核酸疫苗的制備 將本室保存的真核質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)轉化入 E.coli JM109,在氨芐抗性的LB平板上培養(yǎng)14～18小時后挑選菌落克隆擴增,提取質(zhì)粒經(jīng)PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定,篩選陽性菌落。將轉化成功并鑒定正確的重組克隆菌大量擴增培養(yǎng),去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒大量提取真核質(zhì)粒,核酸蛋白定量分析儀測定濃度后,無菌PBS調(diào)整核酸濃度為2 000μg/ml。

1.2.2 動物免疫 選取4～6周齡雌性BALB/c健康小鼠60只,隨機分為5組,即:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA為實驗組;pcDNA3.1(-)/ltB、空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和PBS空白組為對照組,每組均為12只。實驗組接種pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA重組質(zhì)粒,對照組接種pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒和無菌PBS,均接種40 μl。分別于初次免疫后的第2周、4周再免疫2次,共免疫3次,每只80μg/次。

1.2.3 免疫小鼠標本的收集 每次免疫前一天及末次免疫后2周收集小鼠生殖道灌洗液100μl;收集小鼠尾靜脈血50～80μl分離血清,所有標本于-20℃保存;末次免疫后2周剖殺小鼠,無菌取小鼠脾臟,經(jīng)200目尼龍紗布網(wǎng)濾過-制成單個細胞懸液備用。

1.2.4 小鼠生殖道粘膜特異性sIgA的檢測 以純化、復性的重組蛋白NspA為抗原包被ELISA板,以小鼠生殖道灌洗液標本作一抗,采用間接ELISA法檢測sIgA的水平。將重組蛋白用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至 40.0μg/ml,每孔100μl包被 ELISA板,4℃過夜;用PBST洗滌 3次;用封閉液 4℃封閉12小時;PBST洗滌3次,5分鐘/次。加各組小鼠生殖道貫洗液標本,100μl/孔,37℃溫育2小時,PBST洗滌3次,5分鐘/次;再加HRP標記的羊抗鼠sIgA 100μl/孔,37℃溫箱中溫育1小時,PBST洗滌3次,5分鐘/次。最后加入新配置的TMB顯色液顯色并于酶標儀上讀取各孔A450值。

1.2.5 小鼠血清中特異性IgG的檢測 以純化、復性的重組蛋白NspA為抗原包被ELISA板,以小鼠血清標本作為一抗,以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,采用間接ELISA法檢測血清IgG水平。其操作方法同上sIgA抗體的檢測。

1.2.6 ELISA雙抗體夾心法檢測IFN-γ產(chǎn)生水平 將無菌收集的小鼠脾細胞加入5 ml 0.83%NH4Cl放置5分鐘溶解紅細胞,1 000 r/min離心5分鐘收集淋巴細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。臺酚藍染色,調(diào)整活細胞數(shù)為 6×106ml-1,接種于24孔板中,1 ml/孔;每組的每個培養(yǎng)孔加入特異性抗原NspA 10μg,培養(yǎng)板置37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后離心取上清備用;采用雙抗體夾心法檢測IFN-γ含量,具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.7 MTT比色法檢測淋巴細胞的增殖 將無菌收集的小鼠脾細胞加入5 ml 0.83%NH4Cl放置5分鐘溶解紅細胞1 000 r/min離心5分鐘收集淋巴細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。臺酚藍染色,調(diào)整細胞濃度為1×106ml-1,加入96孔板,每孔200μl;每只小鼠脾淋巴細胞分成兩組,特異性抗原NspA刺激組,無刺激的陰性對照組,其中每組重復4孔。NspA刺激組每孔加入 2 μg,混勻后,置37℃、5%CO2培養(yǎng) 72 小時 。于終止培養(yǎng)前4小時每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時后棄上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,震蕩溶解15分鐘,570 nm波長測定各孔的A570值。刺激指數(shù)(SI)=實驗組 A570值/空白對照組 A570值。并用刺激指數(shù)來評價小鼠脾淋巴細胞的增殖程度。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS16.0軟件進行分析。抗體水平、脾細胞刺激指數(shù)及細胞因子水平以±s表示,組間均數(shù)的比較采用方差分析,以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 真核重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,1.0%瓊脂糖凝膠電泳,均能得到目的條帶,大小分別約為ltB(372 bp)、nspA(525 bp)和 ltB-nspA(900 bp),見圖1。

2.2 小鼠生殖道粘膜NspA特異性sIgA抗體水平的檢測 以重組蛋白NspA作檢測用抗原包被ELISA板,間接ELISA法對各免疫組小鼠每次免疫前一天和末次免疫后2周收集的小鼠生殖道灌洗液行sIgA檢測,結果顯示:在不同時間的免疫中,第4周、6周pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠生殖道粘膜sIgA水平(A450:0.296±0.045、0.316±0.048)和pcDNA3.1(-)/nspA 單基因組生殖道粘膜sIgA水平(A450:0.224±0.038、0.249±0.040)均明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)、PBS組(P ＜0.01);此外,第4周、6周 pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠生殖道粘膜sIgA水平明顯高于pcDNA3.1(-)/nspA單基因組(P＜0.05),見圖2。

圖1 真核重組載體經(jīng) PCR和 BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定圖譜(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)Fig.1 Profile of PCR products and digested products by BamHⅠ,HindⅢ of eukaryotic recombinants(1.0%agerose gel electrophoresis)

2.3 小鼠血清NspA特異性IgG抗體的檢測 以重組蛋白NspA作檢測用抗原包被 ELISA板,間接ELISA法對各免疫組小鼠每次免疫前一天和末次免疫后2周收集的小鼠血清行IgG檢測,結果顯示:在不同時間的免疫中,第4周、6周 pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠血清IgG水平(A450:0.521±0.029、0.643±0.156)和pcDNA3.1(-)/nspA 單基因組血清IgG水平(A450:0.500±0.036、0.595±0.142)均明顯高于pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)、PBS組(P＜0.01);但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組與pcDNA3.1(-)/nspA單基因組小鼠血清中IgG水平差異不顯著(P＞0.05),見圖3。

2.4 脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平的檢測 按照說明書建立IFN-γ檢測的標準方程、繪制標準曲線。檢測結果顯示pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA免疫組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01);但 pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA兩組間IFN-γ的水平無顯著性差異(P＞0.05),見表1。

圖2 小鼠生殖道抗NspA特異性sIgA抗體水平Fig.2 sIgA levels of NspA in different intranasally immunized groups

圖3 小鼠生殖道抗NspA特異性IgG抗體水平Fig.3 IgG levels of NspA in different intranasally immunized groups

表1 免疫小鼠脾淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)及培養(yǎng)上清IFN-γ含量(pg/ml)Tab.1 Stimulation index,IFN-γ(pg/ml)in cultured supernatant of splenic lymphocyte from immunized mice

2.5 MTT比色法檢測脾淋巴細胞的增殖反應 用特異性抗原NspA刺激后,pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA免疫組小鼠的脾淋巴細胞刺激指數(shù)明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01),但pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA兩組間差異不顯著(P＞0.05),見表1。

3 討論

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導入動物體內(nèi),并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白,刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫應答,對病原體和腫瘤等產(chǎn)生免疫力的基因疫苗?；蛞呙缭隗w內(nèi)的抗原表達和遞呈過程與病原體的自然感染相似,能直接遞呈并啟動機體免疫系統(tǒng),誘導機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫應答。作為第三代疫苗,與第一代疫苗(減毒、滅活疫苗)及第二代疫苗(亞單位疫苗)相比,因其高效 、持久、廣譜、簡便、廉價、無致病性等優(yōu)勢而得到廣泛的研究和應用[4,5]。

淋球菌NspA是淋球菌最具特征的外膜蛋白,不但能在淋球菌表面持續(xù)表達,而且高度保守、具有較強免疫原性,是一個頗具潛力的淋球菌疫苗候選抗原。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)是大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)分子的非毒性結合亞單位,能與大多數(shù)細胞(包括上皮細胞、白細胞)表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷酯結合,將其與目的抗原混合或偶聯(lián)于目的抗原,通過粘膜免疫途徑免疫動物,可以廣泛激活粘膜免疫系統(tǒng),在粘膜表面產(chǎn)生高效價的特異性的sIgA抗體,而且在血循環(huán)中產(chǎn)生高效價的IgG抗體,同時也可誘發(fā)細胞免疫應答,是目前所知最有效的粘膜佐劑之一[6]?？沽懿∶庖咧饕矿w液免疫,尤其是粘膜免疫,誘導高效的粘膜免疫應答,產(chǎn)生粘膜保護力是評價淋球菌疫苗效果的最重要的指標。實驗證明,粘膜途徑免疫不僅能有效的誘發(fā)粘膜免疫,同時又可誘發(fā)系統(tǒng)免疫應答[7,8]。以 LTB作為粘膜佐劑,促進疫苗抗原產(chǎn)生有效的粘膜免疫應答,是研制經(jīng)粘膜感染病原體疫苗的策略之一。

此外,選擇合適的免疫途徑也十分重要。Zhu等[9]用淋球菌外膜囊泡抗原通過鼻粘膜途徑免疫BALB/c小鼠,發(fā)現(xiàn)可在小鼠生殖道灌洗液中檢測到較高水平的特異性sIgA,血清及生殖道灌洗液中均可檢測到特異性IgG。由此可見,疫苗抗原經(jīng)粘膜途徑免疫能有效誘導粘膜免疫應答。常用的粘膜免疫方法主要包括胃腸道、鼻腔、生殖道等。鼻腔免疫因避免了胃腸道酸性環(huán)境及酶對抗原的破壞、操作簡便易行而被廣泛采用。

本研究采用本課題組構建的淋球菌NspA與大腸桿菌LTB融合基因疫苗,經(jīng)粘膜途徑(鼻飼)免疫雌性BALB/c小鼠,探討粘膜佐劑優(yōu)化的核酸疫苗誘導的體液免疫及細胞免疫水平,尤其是粘膜sIgA水平。結果顯示:ltB-nspA融合基因組及nspA單基因組小鼠生殖道局部sIgA及血清IgG水平均明顯高于pcDNA3.1(-)/ltB、空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和 PBS對照組(P＜0.01),表明經(jīng)粘膜途徑免疫后基因疫苗誘導產(chǎn)生了較高水平的體液免疫應答;ltB-nspA融合基因組sIgA水平明顯高于nspA單基因組(P＜0.05),表明粘膜佐劑LTB能輔佐NspA誘導小鼠產(chǎn)生更強的粘膜免疫應答,與戴志兵等[10]LTB優(yōu)化的抗淋病LTB-PorB重組蛋白的免疫活性的研究結果基本一致,這對有效阻斷淋球菌對粘膜上皮細胞的粘附,從而阻斷其進一步對宿主細胞的感染具有重要意義。小鼠脾淋巴細胞經(jīng)重組抗原NspA刺激后,基因疫苗pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組和pcDNA3/1(-)/nspA組的脾淋巴細胞刺激指數(shù)和培養(yǎng)上清中IFN-γ含量均明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01),表明核酸疫苗經(jīng)粘膜免疫小鼠后,也能誘導小鼠產(chǎn)生較強的特異性細胞免疫。

上述研究結果表明,基因疫苗pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA均能誘導較高水平的體液免疫及細胞免疫應答,尤其是 ltB-nspA融合基因組較nspA單基因組誘導產(chǎn)生了更高水平的粘膜特異性sIgA,證實粘膜佐劑LTB能有效輔佐NspA在小鼠生殖道粘膜誘導產(chǎn)生更高水平的粘膜免疫,為進一步研究高效抗淋病基因疫苗提供了部分實驗依據(jù)。

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10 戴志兵,胡四海,陳 敏 et al.淋球菌porB和大腸桿菌ltB融合基因的構建、表達及其免疫活性[J].微生物學報,2010;50(4):517-523.