LXR激動劑豬脫氧膽酸二甲酰胺對脊椎動物行為的影響

王小巖，蔡懷涵，余 昊，李小蘭，宋 青

（北京科技大學應用科學學院生物科學與技術系，北京 100083）

肝X受體（LXR）是近年來藥物研發(fā)的熱點之一，其生理調節(jié)作用涉及膽固醇、脂肪和糖代謝，與冠心病、2型糖尿病、老年癡呆的發(fā)生緊密相關，是治療這些常見病的藥物作用靶點[1-4]。最近研究報道，LXR-623作為首個進入臨床人體試驗的LXR激動劑，在高劑量組中，實驗者出現不同程度的中樞神經系統(tǒng)紊亂癥狀，表現為頭昏、理解能力下降、健忘和偏執(zhí)意念等[5]。

為避免此類不良反應出現，開發(fā)安全的LXR藥物，本實驗初步建立了簡單的動物行為模型，實驗動物包括魚、鴿子和小鼠三種常見的脊椎動物，通過給藥LXR激動劑豬脫氧膽酸二甲酰胺（王璐等，未發(fā)表數據），進行小鼠曠場（openfield）實驗[6]、鴿子自我識別（self-recognition）實驗[7]、小魚躲避天敵實驗，觀察LXR激動劑對中樞神經的影響，這將為篩選安全有效的LXR調節(jié)藥物提供研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

1.1.1.1 第一批小鼠選用昆明白，雄性，8周齡，10只；第二批選用C57BL21，雄性，8周齡，10只；第三批選用昆明白，雄性，8周齡，40只；小鼠均購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1.1.1.2 鴿子選用16只美國白羽王肉鴿，平均4年，雄雌各半，購于北京市大興區(qū)肉鴿飼養(yǎng)棚。

1.1.1.3 長度為5 cm淡水魚、直徑為10 cm巴西龜，購于北京花鳥魚蟲市場。

1.1.2 實驗藥品與儀器

豬脫氧膽酸二甲酰胺（由本實驗室合成），玻璃魚缸30 cm×20 cm×30 cm（長×寬×高），攝像頭，照相機，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 小鼠曠場行為實驗

第一批昆明白小鼠、第二批C57BL21小鼠進行曠場行為實驗，給藥量均為200 mg/（kg·d）。為了觀察群體行為和平行比較，將每批的5只給藥組和5只對照組放入曠場實驗箱子，對其在中心區(qū)域的穿越次數進行計數。第三批選用昆明白小鼠40只，按平均體重分為5組，采取高密度籠養(yǎng)方法（8只/籠），進行曠場行為實驗來觀察環(huán)境壓力下的藥物作用。

1.2.2 鴿子自我識別實驗

在鴿子飲用水中加入LXR激動劑豬脫氧膽酸二甲酰胺，給藥量為 200 mg/（kg·d），喂養(yǎng) 16 h 后測試。 測試方式采用觀察鴿子對鏡面像和其他鴿子的相對關注程度，了解鴿子中樞神經系統(tǒng)活動，包括注意力、對其他個體的好奇程度、主動交流的愿望、敏感性等。實驗裝置為2個并排的網狀籠子，各放一只鴿子，一面放置鏡子，其他三面用白紙屏蔽，鴿子可以看見彼此及自己的鏡面像。每對鴿子在籠中放置5 min，然后用黑色記號筆在鴿子前部做一個明顯的記號，再在籠中放置5 min。整個過程攝制錄像保存數據及實驗后分析。

1.2.3 魚躲避天敵實驗

魚躲避天敵實驗是通過向水中添加豬去氧膽酸二甲酰胺，使水中豬去氧膽酸二甲酰胺的濃度為20 μmol/L。按照體長挑選出10只，平均分為兩組，每組5只，飼養(yǎng)在2個魚缸中。實驗組水中含有豬去氧膽酸二甲酰胺，對照組為自來水。暴露時間為24 h，測試時將實驗烏龜放入魚缸中并錄像分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠曠場行為實驗

選用不同種系的小鼠（昆明白和C57BL21）做曠場行為實驗。實驗結果顯示，給藥組的動物進入中心區(qū)的次數多于對照組動物（P<0.05）。 見表 1、2。

2.2 環(huán)境壓力下的藥物作用

為了觀察環(huán)境壓力下的藥物作用，本研究采取高密度籠養(yǎng)提高小鼠緊張度，采用曠場實驗分析藥物作用。結果顯示，在高密度籠養(yǎng)的環(huán)境壓力下籠養(yǎng)18 d后，LXR激動劑改變動物探索行為；但是與標準籠養(yǎng)密度條件下藥效相反，服藥動物逐漸喪失進入中心區(qū)的興趣，但是統(tǒng)計分析顯示無顯著差異（表 3）。

表1 昆明白小鼠曠場行為實驗結果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

表1 昆明白小鼠曠場行為實驗結果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

編號 空白對照組 實驗組105229306459549平均次數2.207.60標準方差2.281.95平均進食量（g）9.809.60平均飲水量（g）7.708.80平均體重（g）36.89±2.0432.63±3.15

表2 C57BL21小鼠曠場行為實驗結果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

表2 C57BL21小鼠曠場行為實驗結果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

編號 空白對照組 實驗組128227327454597平均次數4.006.60標準方差3.081.52平均進食量（g）9.0015.60平均飲水量（g）9.1010.90平均體重（g）24.33±0.9125.52±2.54

2.3 鴿子自我識別實驗

本實驗觀察到較為明顯的行為差異，服用LXR激動劑的鴿子表現出對鏡面像的好奇超出對照組。將鴿子照鏡子的行為分類為轉頭、低頭、挪步、轉身、梳羽和扇翅。每對鴿子對鏡面像的興趣大于對彼此的興趣，絕大多數時間與鏡面像對視。給藥組的鴿子表現出更強的主動交流姿態(tài)和舉動（表4）。但是在鴿子被標記后（帶點），都表現出對鏡面像興趣和自主活動下降的傾向（表5）。

表3 高密度籠養(yǎng)壓力下昆明白小鼠曠場實驗結果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

表3 高密度籠養(yǎng)壓力下昆明白小鼠曠場實驗結果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

編號一次服藥量[mg/（kg·d）]050 100 200 300191109235100323000400300511200612111700100810100平均次數2.131.501.250.131.25標準偏差2.951.770.890.353.15平均進食量（g）11.9818.8118.8915.1117.84平均飲水量（g）21.6024.6224.1225.7730.12平均體重（g）35.39±2.4433.00±1.0732.00±1.2032.25±1.0430.75±1.39

表4 鴿子自我識別實驗結果統(tǒng)計分析（不帶點）Tab.4 Pigeon mirror behavior test result(no spot)

2.4 魚躲避天敵實驗

實驗中發(fā)現給藥組的魚與對照組相比，啟動躲避動作的警戒區(qū)域明顯縮小，表現出對天敵的無畏行為（實驗數據未給出）。

表5 鴿子自我識別實驗結果統(tǒng)計分析（帶點）Tab.5 Pigeon mirror behavior test result(spot)

2.5 LXRα配體結合區(qū)的一級結構比對

圖1 對比了人（h）、小鼠（m）、斑馬魚和雞（c）的部分序列，其中紅框內的氨基酸殘基參與配體結合（<7埃）。

圖1 LXRα配體結合區(qū)的一級結構比對Fig.1 Alignment of LXRα LBD amino acid sequence

3 討論

LXR受體基因具有高度的種間保守性[8]。由圖1可以看出，這些物種的LXR受體配體結合區(qū)域的高度保守性，只有一個殘基不同（*號處），而其距配體距離有6埃以上不會直接影響配體結合的特異性?；谏鲜鼋Y構分析可以推斷，能夠激活人LXR受體的激動劑也可以激活其他物種的LXR受體。

大腦中樞神經系統(tǒng)所含膽固醇比外周組織高出很多[9]。由于血-腦屏障的存在，含膽固醇的脂肪顆粒不能有效進入大腦，所以大腦中95%的膽固醇是原位合成的。人體大腦隨年齡增加膽固醇含量逐步下降，而老年癡呆與大腦的膽固醇代謝存在一定的關聯性[10]。所以調節(jié)中樞神經系統(tǒng)的膽固醇代謝對其生理功能產生影響。LXR受體在中樞神經系統(tǒng)的信號傳導表現在多種細胞種類內，包括神經細胞、星狀細胞和微星（腦巨噬）細胞[11]。LXR激動劑可以上調ABCA1蛋白[12]、ApoE蛋白[13]，促進細胞內膽固醇向胞外轉運，使細胞膜內膽固醇濃度下降。神經細胞的突觸結構對細胞膜成分依賴性很強，膽固醇濃度下降可能會影響神經細胞的生理活動。可以推測，外源性高劑量LXR激動劑急性使用，可能會非特異性地降低大腦神經細胞的膽固醇含量，從而影響正常的中樞神經系統(tǒng)功能。

4 結論

本實驗使用LXR激動劑豬脫氧膽酸二甲酰胺對魚、鴿子和小鼠的行為影響做了初步觀察。實驗結果顯示，LXR激動劑急性使用，改變了魚、鴿子和小鼠的正常行為，從而確定了LXR影響中樞神經系統(tǒng)的藥效。臨床使用LXR調節(jié)劑，應努力減小或避免對中樞神經系統(tǒng)的不良影響。本實驗采用的思路可以為安全開發(fā)LXR調節(jié)劑提供簡單可靠的動物行為研究方法。

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