銪原子標(biāo)記技術(shù)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室移液器容量誤差方法

沈 偉 張征軍 孫 杰 邵平揚(yáng) 王志剛/. 浙江省嘉興市計(jì)量檢定測(cè)試所；. 浙江省嘉興市第二醫(yī)院

建立銪原子標(biāo)記技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室移液器容量的比對(duì)與校準(zhǔn)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)小容量移液器容量準(zhǔn)確度與精密度的有效監(jiān)控。采用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)，檢驗(yàn)移液器容量的誤差來(lái)源。時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)批內(nèi)重變性誤差在0.17%～7.8%之間。銪標(biāo)記法與蒸餾水稱(chēng)重法對(duì)移液器容量測(cè)定的比對(duì)試驗(yàn)，相對(duì)誤差-3.9%～0.62%。時(shí)間分辨熒光進(jìn)行移液器容量比對(duì)與誤差評(píng)估，方法靈敏、精確、簡(jiǎn)便, 可適用于臨床實(shí)驗(yàn)室移液器容量的誤差識(shí)別及常規(guī)比對(duì)。

0 引言

移液器、進(jìn)樣器是利用空氣排代原理的量出式加樣器，是臨床實(shí)驗(yàn)室定性與定量分析的常用工具，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、分子生物學(xué)、色譜分析等技術(shù)領(lǐng)域，其容量的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到結(jié)果的可靠性、可比性與可重復(fù)性[1]。據(jù)報(bào)道新購(gòu)置的移液器失準(zhǔn)率為1.56%，則使用1萬(wàn)次以下的失準(zhǔn)率為4%，（1～5）萬(wàn)次失準(zhǔn)率為8.82%，（5～10）萬(wàn)次失準(zhǔn)率為21.7%，10萬(wàn)次以上失準(zhǔn)率為47.6%[2]。故對(duì)移液器進(jìn)行誤差檢驗(yàn)，既是各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的必要條件，又是實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室之間檢驗(yàn)、檢查結(jié)果“一單通”的技術(shù)前提。

目前，移液器的容量檢定有重量分析法和分光光度法兩種[3、4]，我們?cè)趯?shí)際工作中成功探索出用銪原子標(biāo)記技術(shù)對(duì)移液器的容量進(jìn)行誤差識(shí)別，并獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。該方法將銪標(biāo)記技術(shù)的高靈敏性與高穩(wěn)定性結(jié)合起來(lái)，不受氣溫、氣壓的影響，檢測(cè)靈敏度達(dá)10-12～10-14g/L[5]，精密度試驗(yàn)顯示優(yōu)異的性能，尤其適用于小容量移液器的容量比對(duì)。

1 原理與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay, TR-FIA）以鑭系銪原子(Eu)作為示蹤材料（原子序數(shù)63，原子半徑2.56，原子體積28.9 cm3/mol），用β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）為熒光增強(qiáng)液，336～337 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，610～613 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，利用這類(lèi)熒光物質(zhì)熒光壽命長(zhǎng)及Stokes位移大的特點(diǎn)，熒光衰退時(shí)間730 μs，測(cè)定延時(shí)時(shí)間400 μs，通過(guò)波長(zhǎng)和時(shí)間差兩種分辨技術(shù)，有效排除非特異本底熒光的干擾，靈敏度高，標(biāo)記物制備簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好。魯赫曼發(fā)射光譜由時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定，測(cè)定載體為聚乙烯微孔板。以《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）為判斷標(biāo)準(zhǔn)，建立起精確有效、簡(jiǎn)便快速的銪原子標(biāo)記技術(shù)對(duì)移液器容量精確度進(jìn)行比對(duì)與校準(zhǔn)的方法。

1.2 儀器與材料

上海某生物技術(shù)有限公司的ANYTEST時(shí)間分辨熒光分析儀，配220 V電壓、50 Hz頻率的穩(wěn)壓電源；上海某儀器廠(chǎng)的TG-328A型光電分析天平；待檢移液器若干。

1.3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1）聚乙烯微孔板本底檢測(cè)：空白聚乙烯微孔板在時(shí)間分辨熒光分析儀上進(jìn)行本底測(cè)定。

2）銪原子標(biāo)記液制備：上海某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的銪標(biāo)記試劑盒，取30 μL銪加3 mL稀釋液混合成銪標(biāo)記液。

1.4 移液器加樣操作[6] ：

1）溫度平衡：先使移液器、吸液嘴與銪標(biāo)記液溫度平衡30 min后進(jìn)行操作。

2）容量設(shè)定：轉(zhuǎn)動(dòng)移液器頂部調(diào)節(jié)旋鈕，逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)，增大加樣量；順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)，減少加樣量，最終將移液器的容量調(diào)節(jié)到所需刻度。

3）預(yù)吸液：選擇潔凈、合適的滴頭安置在移液器套筒上，稍加扭轉(zhuǎn)壓緊吸液嘴使與套筒之間無(wú)空氣間隙。垂直握持移液器，預(yù)吸入銪標(biāo)記液并排回原容器中，吸液、排液共重復(fù)3次。

4）吸液：垂直握持移液器，把按鈕壓至第一停點(diǎn)，滴頭浸入液面下2～3 mm處,然后緩慢平穩(wěn)地放松按鈕，等1～2 s滴頭完全吸滿(mǎn)后，滴頭離開(kāi)液面，貼壁停留2～3 s，淌走多余的液體。

5）放液：將移液器移至聚乙烯微孔板側(cè)壁，保持垂直狀態(tài)，輕輕壓下按鈕至第一停點(diǎn)位置，等待1～2 s，移動(dòng)滴頭再貼試管壁，完全撳下按鈕，以排盡滴頭內(nèi)的液體，然后將滴頭沿試管內(nèi)壁向上移開(kāi)。

6）動(dòng)作應(yīng)柔和，避免按鈕急速?gòu)椈?；?shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，移液器始終保持垂直狀態(tài)。

1.5 檢測(cè)方法

1）按JJG 646-2006[7]，用重量分析法確定1支移液器作為本次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)移液器。

2）批內(nèi)精密度試驗(yàn)：用標(biāo)準(zhǔn)移液器、待檢移液器分別加銪標(biāo)記液，進(jìn)行批內(nèi)精密度試驗(yàn)。

3）容量比對(duì)試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)移液器與待檢移液器分別吸取同一銪標(biāo)記液各10孔，混勻5 min，即時(shí)進(jìn)行熒光時(shí)間分辨測(cè)定，計(jì)算均值、SD、CV%、相對(duì)誤差R%。

4）穩(wěn)定性檢測(cè)：在即時(shí)、15 min、30 min、60 min，分別再次測(cè)定熒光強(qiáng)度值。

5）誤差的識(shí)別：對(duì)CV%值超過(guò)《JJG 646 —2006》規(guī)定誤差范圍的移液器應(yīng)棄用—隨機(jī)誤差；對(duì)CV%小，但R%超范圍的待檢移液器應(yīng)當(dāng)校正—系統(tǒng)誤差。

6）允許誤差范圍設(shè)定：移液器容量允許誤差范圍和重復(fù)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以JJG 646-2006規(guī)定為準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相對(duì)誤差采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)的百分比。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 時(shí)間分辨熒光批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用已檢定的移液器加銪標(biāo)記液，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50 μL、10 μL、5 μL、1 μL批內(nèi)重復(fù)性誤差 分 別 為 0.17%、0.96%～1.80%、1.67%～2.10%、4.80%～7.80%（表 1）。

2.2 穩(wěn)定性檢測(cè)

表1 銪標(biāo)記法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)移液器的重復(fù)性試驗(yàn)

在即時(shí)、15 min、30 min、60 min，分別再次測(cè)定熒光強(qiáng)度值，見(jiàn)圖1。

圖1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3 銪標(biāo)記法與稱(chēng)重法測(cè)定移液器容量比對(duì)

吸取同一銪標(biāo)記溶液加樣后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算均值、SD、CV%及兩者均數(shù)的相對(duì)誤差R%（表2）。

2.4 非標(biāo)準(zhǔn)移液器的校準(zhǔn)試驗(yàn)

對(duì)CV%值超過(guò)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）規(guī)定誤差范圍的移液器應(yīng)棄用；對(duì)CV%小，但R%超范圍的待檢移液器，先做好刻度記號(hào)，再用移液器專(zhuān)用扳手調(diào)節(jié)頂部旋鈕,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，容量調(diào)大；逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，容量調(diào)小，隨后再進(jìn)行10次標(biāo)記溶液加樣測(cè)定，直至R%小于《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）容量允許誤差范圍之內(nèi),即R%趨向于零。

表2 銪標(biāo)記法與稱(chēng)重法比對(duì)試驗(yàn)

3 討論

目前移液器容量比對(duì)與校準(zhǔn)有兩種方法[8-10]：①?lài)?guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局推薦的蒸餾水稱(chēng)重法作為移液器容量校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該實(shí)驗(yàn)須考慮到氣溫、氣壓條件，同時(shí)兼顧濕度與修正值等因素，整個(gè)操作比較繁瑣，臨床應(yīng)用受到限制，其最大的缺陷還是靈敏度僅為0.1 mg/L，實(shí)驗(yàn)存在人為誤差。②近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出分光比色法校準(zhǔn)移液器，如重鉻酸鉀法、甲基橙法、曙紅法等[11、12]，由于此類(lèi)方法采用“朗拜—比耳”定律，最適宜吸光度在0.05～0.65之間，而對(duì)高、低濃度溶液存在線(xiàn)性偏差，一般分光光度比色法的檢測(cè)靈敏度為10-3～10-4g/L。

銪原子標(biāo)記具有高特異性、高靈敏度、低本底、重復(fù)性好、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、操作簡(jiǎn)便、可以無(wú)數(shù)次重復(fù)檢測(cè)、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)熒光度或相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，來(lái)判斷反應(yīng)體系中被分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的，深受生物醫(yī)學(xué)研究工作者的青睞，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，成為最有發(fā)展前途的超微量分析技術(shù)，是當(dāng)前標(biāo)記免疫分析發(fā)展到新階段的代表[13]。銪原子標(biāo)記的發(fā)射光和激發(fā)光有較大的STOKES位移（200 nm），光譜間干擾小，同時(shí)，本底低（200～400cps）——特異性強(qiáng)；原子標(biāo)記，位阻體積小，檢測(cè)靈敏度高達(dá)10-12～10-14g/L；熒光壽命長(zhǎng)，半衰期長(zhǎng)，穩(wěn)定性高；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍寬——可測(cè)容量范圍廣。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)移液器與待檢移液器對(duì)同一放射性銪溶液各10次吸樣熒光強(qiáng)度值，計(jì)算出各移液器的均值、SD、CV%。從CV%值的大小反映移液器精密度——移液器的隨機(jī)誤差。通過(guò)待檢移液器與標(biāo)準(zhǔn)移液器的CPM均值比較，計(jì)算相對(duì)誤差(R%)，R%值大小反映被檢移液器的準(zhǔn)確度——移液器的系統(tǒng)誤差。對(duì)CV%值超過(guò)規(guī)定者應(yīng)棄用；對(duì)CV%值穩(wěn)定、而相對(duì)R%值超出允許范圍的非標(biāo)準(zhǔn)移液器，可通過(guò)移液器專(zhuān)用扳手調(diào)節(jié)頂部旋鈕，最終達(dá)到對(duì)移液器的比對(duì)與校準(zhǔn)目的。

總之，銪法進(jìn)行移液器容量誤差的鑒別，其方法靈敏、精確、簡(jiǎn)便與實(shí)用，可適用于臨床實(shí)驗(yàn)室移液器的常規(guī)比對(duì)與校準(zhǔn)。

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