毛細(xì)管電泳/柱端安培檢測血清中谷氨酰胺

劉大星，王修德，劉延秋

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是一種具有特殊營養(yǎng)作用的“條件必需氨基酸”[1]，作為體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，體內(nèi)谷氨酰胺代謝的恒定對許多疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切聯(lián)系[2]。快速而有效地測定血中的谷氨酰胺對于谷氨酰胺代謝有關(guān)疾病以及臨床腸內(nèi)外營養(yǎng)研究等方面具有重要意義。目前測定谷氨酰胺常用的方法有液相色譜法[3,4]、氨基酸自動分析儀法、紙層析法[5]、毛細(xì)管電泳法[6～8]等。 其中毛細(xì)管電泳技術(shù)以其高效、快速、靈敏、低耗等優(yōu)點(diǎn)在氨基酸分析中得到快速發(fā)展。但目前國內(nèi)外毛細(xì)管電泳技術(shù)測定谷氨酰胺的檢測法多采用紫外吸收法[8]和激光誘導(dǎo)熒光法[7]，這些檢測法存在靈敏度低或儀器昂貴等缺點(diǎn)。而電化學(xué)檢測法與上述兩種檢測法相比，具有質(zhì)量檢出限低、線性范圍寬、選擇性好、設(shè)備簡單、價格低廉、高效快速等優(yōu)點(diǎn)[9]。本文采用毛細(xì)管電泳/柱端安培檢測系統(tǒng)，選用萘二羧基醛（DNA）作為柱前衍生劑，研究了谷氨酰胺分離與檢測情況，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件，并進(jìn)行了人血清中谷氨酰胺分離檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 83-2.5型自動新伏安儀（閩東分析儀器廠）；3086型X-Y記錄儀（四川儀表四廠）；高壓電源及JF-01型微電流伏安儀（山東省化工研究院與山東大學(xué)聯(lián)合研制）；碳纖維（山東大學(xué)碳纖維研究中心）。碳纖維工作電極（制作方法同文獻(xiàn)[10]）。 彈性石英毛細(xì)管（30 μm i.d.，360 μm o.d.；J&W Scientific incorporated，USA）。L-谷氨酰胺（第二軍醫(yī)大學(xué)政翔科技實(shí)業(yè)服務(wù)部化學(xué)試劑研究室，層析純），NDA（Fluka公司，純度≥99%），其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為亞沸蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 循環(huán)伏安法 在微型電解池中移入1 ml緩沖液，將柱狀碳纖維束工作電極插入溶液中，接通電解池，記錄底液的伏安曲線，加入待測試劑，混勻后記錄樣品的循環(huán)伏安曲線。

1.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測 選好一根長度合適的毛細(xì)管，高壓電源正極與毛細(xì)管進(jìn)樣端插入同一緩沖液池中，負(fù)極與毛細(xì)管出口端的緩沖液池連通，與充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管構(gòu)成回路，形成毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離系統(tǒng)。調(diào)節(jié)三維工作臺上的操作器，在顯微鏡下把工作電極對準(zhǔn)毛細(xì)管的出口。為避免外界干擾，毛細(xì)管出口端的三電極檢測系統(tǒng)放入屏蔽盒內(nèi)，屏蔽盒接地。高壓電源負(fù)極與伏安分析儀的輔助電極相連并接地。向檢測池中注入電泳緩沖液，導(dǎo)通高壓回路與檢測系統(tǒng)，選擇好合適的工作電勢，加高壓，20 min后毛細(xì)管中電流趨于穩(wěn)定，開始電滲進(jìn)樣，電泳分離檢測。柱端安培檢測器構(gòu)造同文獻(xiàn)[11]，本實(shí)驗(yàn)中所有電勢值均相對于飽和甘汞電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷氨酰胺與NDA在CN-存在下衍生產(chǎn)物的伏安特性 在室溫下，在pH＝9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液中，在2.70×10-3mol/L CN-存在下，9.00×10-4mol/L谷氨酰胺與2.70×10-3mol/L NDA的衍生化反應(yīng)產(chǎn)物在碳纖維電極上有良好、穩(wěn)定的氧化響應(yīng)，峰電勢約為0.63 V。衍生化反應(yīng)時間在0.5～8h所得的循環(huán)伏安圖的峰電流值最大且不變；在不同pH的緩沖液中谷氨酰胺進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在pH＝9.7時衍生物有一最大峰電流。因此選擇柱前谷氨酰胺與NDA和CN-衍生化反應(yīng)的條件是：pH＝9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液，反應(yīng)時間為30min。

2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測谷氨酰胺最佳條件

2.2.1 緩沖液的pH值 在pH＝9.7左右，用Na2B4O7－NaOH緩沖體系選擇了5個pH值，研究谷氨酰胺衍生產(chǎn)物的毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測情況。隨pH增加，衍生反應(yīng)產(chǎn)物的遷移時間tm、柱效N隨pH增加而減小，而峰電流ip在pH=9.9時有一最大值。綜合考慮緩沖液pH對遷移時間tm、柱效N、峰電流ip的影響，本文選擇pH為9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液，此時峰電流ip值較大，柱效N值較高，遷移時間tm較短。

2.2.2 分離電壓 隨分離電壓Vs的增大，遷移時間tm減小。當(dāng)Vs=20 kV時，峰電流ip和柱效N均有最大值，故選擇分離電壓為20 kV。此時峰電流、柱效最大，遷移時間較短,基線平穩(wěn)，峰形好。

2.2.3 檢測電勢 在0.95～1.10 V隨檢測電勢Ed的增加，ip值迅速增大，當(dāng)檢測電勢超過1.10 V時，峰電流ip值基本不再隨檢測電勢Ed的變化而變化。由于檢測電勢過高，基線噪音較大，應(yīng)盡量選擇較低的檢測電勢，故本文選擇的檢測電勢為1.10 V。此時檢測靈敏度高，測量重現(xiàn)性好，且基線噪音較小，峰形好。

2.2.4 緩沖液濃度 隨緩沖液濃度的增加，谷氨酰胺衍生物的遷移時間tm延長，柱效N呈上升趨勢。峰電流ip開始隨緩沖液濃度的增加而加大，當(dāng)濃度達(dá)到 2.19×10-3mol/L Na2B4O7－9.39×10-4mol/L NaOH時峰電流ip值達(dá)到最大值后緩慢下降。無其它氨基酸干擾時，選擇該濃度的緩沖液能得到低的檢測限。但血清中的酪氨酸（Tyr）干擾谷氨酰胺的測定，在此濃度的緩沖液中，谷氨酰胺與酪氨酸不能分開（圖1-1）。為提高柱效，增加了緩沖液的濃度， 在 2.00×10-2mol/L Na2B4O7－8.57×10-3mol/L NaOH緩沖液中，雖然谷氨酰胺的峰高有所降低，峰變寬，但卻可以使谷氨酰胺與酪氨酸很好地分離（圖1-2），分離度為2.0。所以在測定血清中谷氨酰胺時，本研究選擇的緩沖液為：2.00×10-2mol/L Na2B4O7－8.57×10-3mol/L NaOH。

圖1 谷氨酰胺、酪氨酸衍生產(chǎn)物電泳圖

2.3 分析應(yīng)用

2.3.1 重現(xiàn)性、檢測限和線性范圍 對5.00×10-5mol/L的谷氨酰胺衍生產(chǎn)物測定8次，遷移時間tm、峰電流ip的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%和3.1%。對1.00×10-6mol/L的谷氨酰胺衍生產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測，得到高于基線3倍的響應(yīng)值，因此得到信噪比S/N=3時谷氨酰胺的濃度檢測限為1.0×10-6mol/L，質(zhì)量檢測限為1.08×10-15mol/L（1.08 fmol）。谷氨酰胺的線性范圍為 1.00×10-6mol/L～1.00×10-4mol/L，斜率為 1.1 pA/μmol·l，截距為0.27 pA，線性回歸系數(shù)為0.999 8。

2.3.2 人血清中谷氨酰胺的測定 取人血清200 μl，加99%的乙醇600 μl，立即在旋渦振蕩器上充分混合振蕩，置4℃冰箱中10min后，1500×g離心15min除去血清中的蛋白，取上清液備用。取去除蛋白的血清 40 μl，分別加入緩沖液 900 μl，0.01 mol/L CN-30 μl和 0.01 mol/L NDA 30 μl， 反應(yīng) 30 min 后進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測，得到人血清毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖（圖2）。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測得人血清中谷氨酰胺的含量為619 μmol/L。回收率為95%～103%。

圖2 血清中谷氨酰胺毛細(xì)管電泳圖其余實(shí)驗(yàn)條件同圖1-2

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